肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia,PJP）常发生于免疫功能低下的人群,发病率约5%-15%左右。患者出现发热、咳嗽、呼吸急促等临床症状,若未早期有效干预,可快速出现呼吸衰竭,重症患者病死率可高达60%。肺孢子菌感染后炎症因子大量释放引发炎症风暴可以导致急性肺损伤,但是目前关于PJP发生后炎症因子表达情况尚不清楚,其作用机制尚不明确,干预措施更是缺乏。1,3-β-D-葡聚糖（1,3-β-D-glucan,BDG）是肺孢子菌细胞壁的主要成分,肺泡巨噬细胞可以通过BDG受体识别肺孢子菌,激活后发挥吞噬及清除作用。但是大量的BDG可能会造成巨噬细胞过度激活导致大量炎症因子释放造成免疫损伤,而炎症因子是否参与调节巨噬细胞免疫反应尚不清楚。核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）是导致炎症的关键信号通路,广泛参与巨噬细胞等免疫反应过程中。NLRP3（NLR pyrin domain containing 3）是在巨噬细胞中最具特征性的炎症小体,可以导致炎症反应,引起巨噬细胞焦亡。由于孢子菌感染后肺脏内有大量炎症性巨噬细胞,因此我们推测肺孢子菌介导的急性肺损伤很可能与NF-κB及NLRP3有关,但目前尚未见相关报道。在本论文中,将主要针对筛选出的炎症因子在肺孢子菌介导的急性肺损伤中的参与调节作用进行探讨。第一部分肾移植受者发生PJP后炎症因子表达谱的研究研究背景细胞因子包括促炎因子和抑炎因子,正常情况下维持一种平衡状态。但是当免疫系统过度激活时,会因为大量炎症因子的释放造成免疫损伤。肺孢子菌感染后出现免疫系统的过度激活以及大量炎症因子释放的现象,被认为是PJP加重的重要原因。因此当孢子菌感染后,早期识别高表达的炎症因子,对其功能进行干预,可能是阻止PJP向重症进展的重要手段。但是目前关于PJP发生后炎症因子表达情况尚不明确。研究目的1.对肾移植后发生PJP患者进行细胞因子检测,筛选出高表达的细胞因子,并初步进行生信学分析。2.对有促炎症作用的细胞因子扩大样本量进一步验证,了解PJP发生后机体内高表达的炎症因子。研究方法1.根据入排标准,肾移植受者分为PJP组与对照组。两组各选择4例患者运用蛋白芯片法对外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）进行检测,筛选出高表达的细胞因子,并进行生信学分析。2.针对蛋白芯片法筛选出的高表达的炎症因子,采用ELISA法对所有入组患者外周血中的浓度进行检测。研究结果1.共入组肾移植后PJP患者40例,术后健康受者40例。随机选取两组各4例采用蛋白芯片法进行检测,共19个细胞因子上调（＞1.2倍）,生信分析提示TNF-α（tumor necrosis factor-α）、TNF-β（tumor necrosis factor-β）以及 IL-1β（Interleukin-1 β）具有促炎作用,其中TNF-β较对照组显著升高（P＜0.05）。2.PJP患者外周血中TNF-β浓度较对照组显著升高（P＜0.01）,TNF-α及IL-1β浓度两组之间无显著差异。研究结论1.肾移植受者发生PJP后,大部分细胞因子表达呈现上调趋势,生信分析提示差异细胞因子可以参与调控免疫细胞的激活活化,促进炎症反应。2.肺孢子菌感染后TNF-β在外周血单个核细胞中表达上调,血浆中浓度升高,提示TNF-β很可能参与了肺孢子菌介导的免疫损伤。第二部分TNF-β参与BDG诱导的巨噬细胞炎症反应的研究研究背景BDG是肺孢子菌细胞壁主要成分,肺泡巨噬细胞可以通过BDG受体识别肺孢子菌,发挥吞噬及清除作用。大量BDG可能导致肺泡巨噬细胞过度激活,释放炎症因子造成免疫损伤。TNF-β是常见的炎症因子之一,第一部分研究发现,TNF-β在PJP患者外周血单个核细胞中表达上调,血浆中浓度也显著升高,提示TNF-β很可能参与了肺孢子菌介导的免疫损伤中,但是其具体参与方式尚不清楚,对BDG诱导的巨噬细胞有何影响尚不明确。研究目的1.分析BDG在PJP患者外周血中的浓度,研究其应用价值,为采用BDG建立细胞模型进一步研究提供理论基础。2.建立细胞模型,在细胞水平上研究BDG对巨噬细胞的激活作用,并使用TNF-β进行刺激,了解BDG诱导的巨噬细胞分泌炎症因子的变化情况,研究TNF-β促进炎症反应的具体方式。研究方法1.回顾性分析PJP患者临床特点以及外周血中BDG水平情况,计算其敏感性、特异性及其诊断效能。2.通过BDG诱导激活巨噬细胞,检测巨噬细胞上清液中NO水平以及TNF-α、IL-6及IL-1β浓度情况,建立BDG诱导巨噬细胞模型。3.研究TNF-β刺激后巨噬细胞上清液中NO水平以及TNF-α、IL-6及IL-1β浓度情况。研究结果1.PJP患者外周血BDG水平显著升高,高达83.6%患者出现缺氧症状,BDG的诊断敏感性为74.5%,特异性为89.6%,ROC曲线下面积为0.845。2.随着BDG浓度的增加,巨噬细胞上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β浓度以及NO含量也进一步升高,TNF-β刺激后TNF-α、IL-6及IL-1β浓度以及NO含量进一步升高。研究结论1.PJP患者外周血BDG水平明显升高,绝大部分患者出现缺氧症状,BDG在诊断PJP方面具有较高的应用价值。2.TNF-β可以在BDG的基础上进一步促进巨噬细胞的炎症反应,导致炎症水平显著升高。第三部分TNF-β调控肺孢子菌介导的急性肺损伤分子机制的研究研究背景NF-κB广泛参与巨噬细胞的激活活化等免疫反应中,是导致炎症反应的关键信号通路之一。NLRP3是在巨噬细胞中最具特征性的炎症小体,高表达导致炎症风暴可以引起巨噬细胞焦亡。由于孢子菌感染后肺脏内有大量炎症性巨噬细胞,因此我们推测肺孢子菌介导的急性肺损伤可能与NF-κB及NLRP3有关,但目前尚未见报道。本部分将重点对TNF-β调控免疫损伤的分子机制展开研究。研究目的1.提取PJP患者肺泡巨噬细胞,观察细胞形态改变并研究NF-κB通路激活以及NLRP3蛋白表达情况。2.研究在BDG诱导的巨噬细胞中,TNF-β对NF-κB通路及NLRP3蛋白表达的影响,以及干预NF-κB与NLRP3功能后的变化情况。3.研究TNF-β对NLRP3炎症小体通路蛋白表达的影响,探讨TNF-β导致巨噬细胞焦亡的机制。研究方法1.采用扫描电镜观察PJP患者肺泡巨噬细胞的形态改变,免疫荧光的方法检测NF-κB P65入核以及NLRP3蛋白表达情况。2.建立BDG诱导巨噬细胞模型,TNF-β进行刺激,采用ELISA法检测炎症因子表达情况,Western blot法检测NF-κB P65磷酸化水平及NLRP3蛋白表达情况,免疫荧光法检测NF-κB P65入核及NLRP3蛋白表达情况。以及对NF-κB、NLRP3功能进行干预后的变化情况。3.建立BDG诱导巨噬细胞模型,TNF-β进行刺激,ELISA法检测LDH表达情况,Western blot 法检测 Cleaved-GSDMD（Gasdermins D）,actived-Caspase1（Cys-Asp Specific Proteinase-1）,Pro-IL-1β,IL-1β 表达情况,免疫荧光法检测IL-1β表达情况。研究对NLRP3功能进行干预后的变化情况。研究结果1.研究发现PJP患者的巨噬细胞有明显的增大、裂孔等细胞焦亡特征改变,免疫荧光检测发现NF-κB P65入核增多,NLRP3的表达上调。2.研究发现TNF-β可以在BDG的基础上,进一步促进NF-κB P65通路的激活以及NLRP3的表达,通过干预NF-κB以及NLRP3的功能,可以下调炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β的水平。干预NF-κB通路,可以下调NLRP3的表达,干预NLRP3可以抑制NF-κB通路的激活。3.研究发现TNF-β可以在BDG基础上进一步上调NLRP3/Caspase-1/IL-1 β炎症小体通路蛋白的表达,巨噬细胞上清液中LDH（lactate dehydrogenase）含量显著升高,而通过干预NLRP3功能可以下调炎症小体通路蛋白的表达以及LDH含量。研究结论1.肺孢子菌可以导致肺泡巨噬细胞出现肿胀及裂孔等焦亡特征改变,伴随着NF-κB通路的激活及NLRP3的高表达。2.TNF-β通过NF-κB/NLRP3双通路促进巨噬细胞产生炎症反应,干预NF-κB与NLRP3功能可以降低炎症反应,NF-κB与NLRP3具有相互调节作用。3.TNF-β可以激活NLRP3炎症小体通路,引起巨噬细胞焦亡,通过干预NLRP3功能可以减少焦亡发生。