A型流感病毒经常给养殖业带来严重经济损失,同时影响人类健康。研究报道H9N2流感病毒可以感染禽、猪和人,其研究具有重要的公共卫生学意义。流感病毒的致病机制目前普遍认为由于病毒的有效复制带来的直接损伤、病毒所致炎性因子的大量释放和氧化应激损伤造成的,但其详细机制仍需进一步研究。研究证实流感病毒可以诱导细胞自噬,但其在流感病毒致病机制中的作用尚不明确。因此本研究探讨了细胞自噬在流感病毒致病机制中的作用。主要研究结果如下:1.H9N2流感病毒诱导A549发生细胞自噬的研究H9N2流感病毒感染A549细胞,透射电镜观察到了单层膜的自噬溶酶体,western blot结果显示LC3-II的表达水平显著增加。本研究建立了稳定表达GFP-LC3的A549细胞系。激光共聚焦结果显示感染H9N2流感病毒的细胞中呈现了绿色荧光的点状聚集,说明H9N2流感病毒诱导A549发生细胞自噬。2.细胞自噬与H9N2流感病毒复制关系的研究本研究利用3-MA、LY294002以及Atg5 siRNA抑制细胞自噬或者利用rapamycin诱导细胞自噬,检测NP mRNA水平和表达水平以及病毒滴度。结果显示LY294002和Atg5 siRNA可以显著降低NP mRNA水平和表达水平,同时降低病毒滴度。3-MA也可以降低NP mRNA水平和病毒滴度。Rapamycin显著增加NP mRNA水平和病毒滴度。说明抑制细胞自噬降低病毒复制。3.细胞自噬参与H9N2流感病毒所致A549细胞炎性因子释放的研究利用3-MA和Atg5siRNA抑制细胞自噬,实时定量PCR检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8和CCL5的mRNA水平。结果显示抑制细胞自噬降低由H9N2流感病毒引发的炎性因子mRNA水平的升高。同时抑制细胞自噬可以将接种不同MOI H9N2流感病毒引起的炎性因子升高的显著差异降低到同一水平,因此抑制细胞自噬导致的炎性因子mRNA水平的降低并非由于抑制细胞自噬导致的病毒滴度的降低引起。此外,Akt-mTOR信号调节H9N2流感病毒诱导的细胞自噬,细胞自噬通过调节p38MAPK、JNK、ERK1/2和NF-κB信号参与H9N2流感病毒诱导的炎性因子的释放。4.细胞自噬与H9N2流感病毒诱导A549细胞氧化应激作用关系的研究抑制细胞自噬或者诱导细胞自噬,检测SOD1、ROS和MDA的水平以确定细胞自噬与氧化应激的关系。结果显示3-MA、LY294002以及Atg5 siRNA抑制细胞自噬显著降低由H9N2引起的氧化应激作用的升高。抑制细胞自噬可以将因接种不同MOI H9N2引起的氧化应激作用增加的显著差异降低到同一水平。Rapamycin诱导细胞自噬可以增强A549的氧化应激作用。因此,抑制细胞自噬导致的氧化应激作用的降低并非由抑制细胞自噬导致的病毒滴度的降低引起。此外,NAC和Atg5siRNA同时处理进一步降低氧化应激水平、NP mRNA水平和病毒滴度,而H2O2起到相反作用,说明细胞自噬通过调节H9N2诱导的氧化应激作用而影响病毒的复制,这一作用受到信号AKT/TSC2/mTOR的调节。5.细胞自噬参与H9N2流感病毒诱导小鼠急性肺损伤的研究在小鼠体内验证细胞自噬是否通过参与病毒复制,病毒引起的炎性因子的释放以及氧化应激损伤参与H9N2流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤。结果显示3-MA或者体内转染Atg5siRNA抑制细胞自噬可以降低急性肺损伤小鼠死亡率、缓减肺水肿、减轻病理变化。抑制细胞自噬降低流感病毒的复制、降低急性肺损伤小鼠炎性因子的释放和缓减氧化应激作用。此外,Akt-mTOR信号调节H9N2流感病毒诱导的细胞自噬,而细胞自噬通过调节p38 MAPK、JNK、ERK1/2和NF-κB信号参与急性肺损伤小鼠炎性因子的释放。结论:（1）抑制细胞自噬可以抑制H9N2流感病毒复制。（2）抑制细胞自噬降低由病毒所致A549细胞炎性因子的释放。信号AKT-mTOR调节细胞自噬,细胞自噬通过p38MAPK、JNK、ERK1/2以及NF-κB通路介导炎性因子的释放。（3）抑制细胞自噬能降低H9N2流感病毒所致A549细胞的氧化应激作用。细胞自噬通过调节氧化应激作用影响病毒复制,这一作用受到信号AKT/TSC2/mTOR的调节。（4）细胞自噬通过调节病毒复制,炎性因子的释放以及氧化应激作用参与H9N2流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤。抑制细胞细胞自噬可以缓减H9N2流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤。因此,细胞自噬是H9N2流感病毒致病的重要机理之一。