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家蚕是重要的经济吐丝昆虫,蚕桑产业在我国农业经济生产中占有重要的地位。由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的血液型脓病是家蚕的重大病害。由于没有有效的治疗方法,抗BmNPV的转基因家蚕品种的培育受到了越来越多的关注。在转基因工程中,由于组成型启动子转录表达没有时空限制的缺陷,而诱导型启动子具有受到特定的信号刺激才会高量表达的特点越来越受到青睐。39K启动子是BmNPV病毒诱导型启动子,但是39K启动子的序列相对较长,不利于转基因载体的构建,限制了39k启动子在转基因工程中的利用。因此,对39K启动子的结构特征进行分析,构建人工诱导型启动子对于39K启动子的利用显得尤为重要。 本研究通过荧光定量PCR以及双荧光素酶活性检测等方法鉴定了39K启动子的启动调控基因;对39K启动子进行5′端截短、3′端截短以及中间缺失改造,并检测各个改造的启动子转录活性,分析了39K启动子的结构特征;以点突变以及39K结构特征为策略,构建并筛选了高效的人工诱导型启动子。主要研究结果如下: 1.39K启动子启动调控基因鉴定 根据NCBI公布的BmNPV5个极早期基因(ie-0,ie-1,ie-2,pe38以及me53)的核苷酸序列,分析并克隆了这5个极早期基因,成功构建了相对应的过表达载体pIZ-ie0-HA、pIZ-ie1-HA、pIZ-ie2-HA、pIZ-pe38-HA和pIZ-me53-HA。荧光定量PCR分析以及双荧光素酶活性检测发现,只有ie-1基因的过表达载体能够使39K启动子启动下游基因的表达,说明在BmNPV5个极早期基因中,能够诱导39K启动子启动下游基因转录表达的是ie-1基因。 2.39K启动子的结构特征 对39K启动子进行5′端截短,3′截短以及中间缺失,并构建相应的荧光素酶报告基因检测载体。检测并分析各个载体的相对荧光素酶活性,发现能够增强39K启动子活性的片段有+116~+76片段、+62~+1片段、+1~-223片段、-273~-473片段;能够抑制启动子活性的片段有+136~+116片段、+76~+62片段以及-223~-273片段;与组成型启动子活性相关的片段有+1~-273片段。 3.人工诱导型启动子的构建 为了更好地改造39K启动子,本研究对39K启动子的6个CAAT位点进行点突变,构建了相应的荧光素酶报告基因检测载体。载体的相对荧光素酶活性检测结果表明,对39K的329以及399位点的CAAT进行突变,启动活性分别提高了164.37%和64.09%;将93、248以及560位点的CAAT突变为CGGT,启动子的诱导活性没有发生显著性变化;306位点的CAAT突变之后,启动子的诱导活性下降了37.31%。 根据39K启动子的结构特征:缺失+136~+62片段、+1~-273片段启动子转录活性上调,缺失-573~-773片段启动子转录活性下调不显著;以及-329和-399位的CAAT点突变后启动子转录活性上升的结果,选取这5个因素作为39K启动子改造的策略,构建了11个人工诱导型启动子,分别命名为P-39K-1、P-39K-2、P-39K-3……P-39K-11。启动子转录活性检测结果表明:P-39K-9的转录活性与39k启动子相比诱导型活性上升了13.31%,P-39k-1、P-39k-5以及P-39k-6的转录活性分别为39K启动子的87.24%、75.94%和63.57%。其他7个启动子由于转录活性与39K启动子相比发生了显著性的降低。其中P-39k-1的转录活性虽然只有39K启动子的87.24%,但是启动子的长度只有362bp,与39K启动子全长相比短了60.17%,因此选P-39k-1作为最终选定的人工诱导型启动子。