目的：本实验拟以成肌细胞和骨碎补总黄酮(assemble flavone of rhizome drynaria，AFDR)为研究对象，探讨AFDR对体外培养转睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophicfactor, CNTF)基因的成肌细胞增殖、成骨细胞分化的影响及AFDR促进其向成骨细胞诱导分化的作用机制；并将AFDR含药血清预处理的转CNTF成肌细胞微囊化处理达到免疫隔离效果，与负载骨形态发生蛋白(Bone morpnogenetic protein,BMP)的透明质酸(Hyaluronicacid,HA)钠凝胶载体、引导性骨再生(guided bone regeneration,GBR)膜——硅胶管联合构建新型组织工程化人工骨，通过动物在体实验观察引导性骨再生(GBR)促进骨缺损修复的效果；评价成肌细胞作为新型种子细胞、AFDR作为新型成骨诱导因素应用于骨组织工程学研究的可行性。材料与方法：第一部分转染CNTF基因促进大鼠成肌细胞去分化的实验研究取新生5d清洁级Wistar大鼠4只，采用改良法体外分离、培养、纯化成肌细胞，并进行鉴定备用。应用质粒快速提取盒提取CNTF质粒DNA，通过阳离子脂质体法介导转染大鼠成肌细胞影响其分化过程，促使其保持去分化的干细胞状态，并对转染细胞的细胞活性、表达情况和细胞分化率等进行相关检测，结果进行统计学处理；第二部分骨碎补总黄酮促进转CNTF成肌细胞向成骨分化的实验研究及机制探讨取健康12月龄雌性Wistar大鼠20只，随机分为高、中、低剂量给药组及空白血清对照组，每组5只，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”给予AFDR灌胃，无菌条件下由腹主动脉取血、离心、取上清、灭活补体、抽滤除菌制备不同浓度AFDR含药血清；将转CNTF成肌细胞按实验设计分为A、B、C、D、E5组分别加入相应培养液进行预处理，其中A组（高浓度AFDR组）：培养液为高浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；B组（中浓度AFDR组）：培养液为中浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；C组（低浓度AFDR组）：培养液为低浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；D组（空白血清组）：培养液为空白血清+成骨诱导剂；E组（标准培养液组）：培养液为完全培养液。连续培养21天，观察预处理后转CNTF成肌细胞的增殖、成骨分化情况，进行MTT测定，碱性磷酸酶、茜素红、I型胶原染色观察，骨钙素、钙沉积量、ALP比活性等成骨标志物检测及成骨、成脂相关基因测定，并进行统计学分析。第三部分微囊化骨碎补总黄酮预处理转CNTF成肌细胞促进引导性骨再生的实验研究取第二部分中C组培养液（低浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂）对转CNTF成肌细胞进行成骨诱导分化，行相关检测后继续培养备用。对上述转CNTF成肌细胞及AFDR预处理的转CNTF成肌细胞进行微囊化处理，测定细胞存活率。取清洁新西兰大白兔24只行桡骨缺损造模，根据处置条件随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，每组6只动物，以硅胶管为GBR膜，分别植入不同的移植物，其中Ⅰ组为AFDR预处理转CNTF成肌细胞微囊与负载BMP的HA凝胶组，Ⅱ组为转CNTF基因成肌细胞微囊与负载BMP的HA凝胶组，Ⅲ组为仅负载BMP的HA凝胶组，Ⅳ组为仅注入HA凝胶组，术后进行大体观察、X线测定及组织学染色的检测，并进行统计学分析。结果：1.采用改良方法可获得生长状态良好的成肌细胞，通过扫描电镜及结蛋白抗体染色鉴定呈阳性；通过实验可成功提取CNTF质粒并转染大鼠成肌细胞，转染CNTF的成肌细胞能分泌表达CNTF mRNA，其细胞分化率下降而处于去分化状态。2.实验成功获取高、中、低浓度AFDR含药血清及空白血清；采用不同浓度AFDR含药血清（包括空白血清）对转CNTF成肌细胞进行预处理，并与标准培养液培养的转CNTF成肌细胞进行观察比较。(1)倒置相差显微镜下观察：培养过程中AFDR预处理的转CNTF成肌细胞大多向梭形、多角形转化，有的带有数个突起，在继续培养过程中逐渐形成多个散在的岛状致密细胞群结构，细胞密集成旋涡状，中间细胞排列紧密模糊，逐渐被含有高折射的空泡和深色颗粒的基质包埋形成白色钙化结节，其中以低浓度AFDR含药血清组最为明显；(2)MTT结果显示：不同处理组中转CNTF成肌细胞随着时间迁移均呈现不同程度的增殖，在第5-6天时达到增殖高峰，第7天开始呈现下降趋势。在同一时间点上，在低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组OD值高于标准培养液组(p＜0.05)，其中低浓度AFDR含药血清组的作用最强；(3)碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Ⅰ型胶原的免疫组化染色结果显示：除标准培养液组染色呈阴性外，其余各组转CNTF成肌细胞的胞质中均分别出现紫黑色颗粒或块状沉淀、橘红色的沉淀、棕黄色颗粒沉淀，呈相应染色阳性，而且以低浓度AFDR组反应最强，高浓度AFDR组最弱，中浓度AFDR组与空白血清组相当；(4)成骨细胞标志物检测显示：①OCN含量在细胞培养第7d时，五组间差异没有统计学意义(p＞0.05)，在培养第14d和第21d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组中OCN分泌量均高于标准培养液组，低浓度AFDR组OCN分泌量明显高于中浓度AFDR组、空白血清组，差异有统计学意义(p＜0.05)；在不同时间点同组之间进行比较发现，除高浓度AFDR组和标准培养液组外，其余三组中第21dOCN分泌量均明显高于第14d、第7dOCN分泌量，且第14d OCN分泌量亦高于第7dOCN分泌量；②钙沉积量测定在培养第3d、6d、9d时，五组间差异没有统计学意义(p＞0.05)；在第12d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组中钙沉积量均高于空白血清组、标准培养液组，而低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组3组间中钙沉积量及空白血清组、标准培养液组2组间中钙沉积量均没有统计学差异；在培养第15d、18d和第21d时，五组间差异均有显著性意义(p＜0.01)，进一步两两比较，培养第15d、18d和第21d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组中钙沉积量均高于标准培养液组，而且空白血清组亦钙沉积量均高于标准培养液组；③ALP比活性测定在不同时间点进行不同处理组间方差分析结果显示，在培养第1d、3d时，五组间差异没有统计学意义(p＞0.05)；在第7d、11d、14d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组中ALP比活性均明显高于高浓度AFDR组、标准培养液组，且低浓度AFDR组ALP比活性明显高于中浓度AFDR组、空白血清组，差异有统计学意义(p＜0.05)，中浓度AFDR组、空白血清组中ALP比活性差异没有统计学意义(p＞0.05)；高浓度AFDR组与标准培养液组中ALP比活性均极低，且差异没有统计学意义(p＞0.05)。（5）在第14d时检测5组Cbfa1mRNA、ALP mRNA、PPARγ mRNA表达，结果显示各组间差异均有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)，以低浓度AFDR组对转CNTF成肌细胞向成骨细胞分化过程中Cbfa1mRNA、ALP mRNA、PPARγ mRNA表达的影响最为显著。即低浓度AFDR（按AFDR67.5mg/kg.d给药）组成骨相关因子Cbfa1mRNA、ALP mRNA表达最高，成脂相关因子PPARγ mRNA表达最低。3.微囊化细胞体外存活良好，微囊外形完整无粘连，大小较均一，囊内细胞清晰可见；动物在体实验中Ⅰ组微囊化AFDR预处理转CNTF成肌细胞与BMP因子组引导性再生促进骨缺损修复的各项指标均优于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组3组，组间差异均有显著性，p<0.05。结论：1.应用CNTF基因转染成肌细胞能够抑制成肌细胞体外成肌分化，保持成肌细胞去分化状态，为成肌细胞被用作组织工程研究的种子细胞提供理论基础。2.转CNTF成肌细胞在体外经成骨诱导剂诱导后能够转化为成骨前体细胞。3.AFDR含药血清可显著促进转CNTF成肌细胞的体外增殖和成骨分化，提示AFDR具有开发为促进骨折愈合、抗骨质疏松新药的潜力。4.AFDR含药血清促进转CNTF成肌细胞体外增殖和成骨分化均以低浓度AFDR含药血清作用最强，而高浓度AFDR含药血清抑制其增殖、分化，说明AFDR对转CNTF成肌细胞体外增殖和成骨分化与其浓度相关。5.AFDR含药血清促进转CNTF成肌细胞体外成骨分化机制与其在成骨分化过程上调Cbfa1mRNA、ALP mRNA表达，下调PPARγ mRNA表达有关。6.AFDR和成肌细胞联合应用可促进骨缺损的修复，两者可应用于骨组织工程学研究。7.创新性的应用引导性骨再生理论将透明质酸钠凝胶和硅胶管的应用于骨缺损的修复可以取得良好的修复效果，且两者已应用于临床，可以作为良好的骨组织工程材料。