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研究背景:SHP2是一个由PTPN11基因编码的蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2包含两个SH2区域,分别为N-SH2和C-SH2,一个酪氨酸磷酸酶催化区域(protein tyrosine phosphatase,PTP),C端还具有两个酪氨酸磷酸化位点及一段脯氨酸富集序列。SHP2能够介导细胞因子,生长因子以及激素的功能,从而促进细胞的增殖和存活。在实体肿瘤和恶性血液性疾病中,SHP2一直以来被认为是一个促癌基因。在50%的努南氏综合征患者中发现有SHP2的品系突变,而且在血液恶性疾病、乳腺癌、肺癌中,也发现了功能增强的SHP2的体细胞突变。在胃癌细胞中,细胞毒素相关蛋白(cytotoxin-associated antigen A,Cag A)磷酸化后与SHP2结合,激活其磷酸酶活性,导致下游ERK/MAPK通路活性增强,诱导胃上皮细胞出现类生长因子刺激的反应;然而在肝癌细胞中,SHP2能够促进细胞衰老,敲除SHP2促进了二甲基亚硝胺诱导的肝细胞癌。这些结果说明SHP2在不同组织器官中具有功能特异性。在中国和西方国家中,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发生率和死亡率都位居前列。最近有研究表明肠上皮细胞SHP2敲除促进了肠炎的自然发生。遗传学研究表明SHP2编码基因PTPN11是炎症肠疾病的敏感性基因,而且溃疡性肠炎患者中PTPN11基因的转录水平明显下调。结合临床数据,通过流行病学研究表明SHP2在CRC中的低表达与高死亡率等不良预后相关,提示SHP2在结直肠癌中发挥抑癌功能。此外,已有文献报道多种化合物,如非甾体抗炎药氨基水杨酸、NS-398(选择型环氧合酶-2抑制剂)以及X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)抑制剂蒽贝素能够通过激活SHP2磷酸酶活性或提高SHP2表达从而发挥抑癌作用。但是目前尚无研究表明SHP2与CRC恶性表型,如增殖、迁移、凋亡等直接相关,因此SHP2在CRC细胞中的功能还需要更广泛的探究。目的:探讨SHP2对CRC细胞增殖、迁移的影响;探究SHP2在CRC细胞中的分子机制。方法:1.利用Western Blotting和Real-time PCR检测不同CRC细胞(SW480,HCT116,RKO,Lo Vo)中SHP2表达。2.利用Western Blotting和Real-time PCR评价SHP2 si RNA和野生型SHP2过表达质粒的转染效率;通过敲减,过表达和SHP2磷酸酶活性抑制,检测SHP2在CRC细胞增殖和迁移中的功能。利用MTT和平板克隆形成实验检测CRC细胞的增殖,通过transwell实验检测细胞的迁移。3.利用Western Blotting检测SHP2对STAT3磷酸化的调控作用。4.利用Real-time PCR检测SHP2对JAK2/STAT3通路中其他蛋白(gp130、IL-6R、JAK2、SOCS3)表达水平的影响。5.利用细胞免疫荧光实验检测SHP2对p-STAT3细胞定位的调控。结果:1.SHP2能抑制CRC细胞的增殖和迁移1.1在四株CRC细胞中(SW480、HCT116、RKO、Lo Vo),SHP2的表达水平不同:HCT116和RKO中SHP2高表达;SW480和Lo Vo中SHP2低表达。因此我们选择SHP2高表达的HCT116和低表达的SW480作为研究对象。1.2敲减SHP2促进了CRC细胞SW480和HCT116的增殖和迁移。反之在SHP2低表达的SW480细胞中,SHP2的过表达显著的抑制了细胞的增殖和迁移;同时以MCF-7为对照,敲减SHP2抑制了乳腺癌细胞的增殖。1.3利用SHP2磷酸酶抑制剂PHPS1抑制SHP2的催化活性促进了结直肠细胞SW480和HCT116的增殖和迁移。2.在CRC细胞中,SHP2通过调控STAT3磷酸化发挥抑癌功能2.1 SHP2能够负向调控CRC细胞中已知癌基因STAT3的磷酸化:敲减SHP2后,CRC细胞中STAT3磷酸化明显增强;相反过表达SHP2后STAT3磷酸化水平下降;同时PHPS1抑制SHP2磷酸酶活性后STAT3磷酸化明显增强。2.2回复实验证实SHP2对STAT3磷酸化的调控介导了SHP2对CRC细胞增殖的抑制作用。2.3 SHP2敲减促进了IL-6诱导的SW480细胞的增殖。结论:本研究表明SHP2能够直接抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移,其分子机制是SHP2通过调控STAT3磷酸化发挥抑癌功能。