论文部分内容阅读
目的:1.体外抑制性实验观察青蒿琥酯(ATS)、双氢青蒿素(DHA)和紫杉醇(Taxol)单药以及ATS联合Taxol给药对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖的影响,以评价药物对小鼠黑色素瘤B16细胞的增殖抑制作用以及ATS联合Taxol给药对小鼠黑色素瘤B16细胞的影响。2.观察ATS对小鼠黑色素瘤B16细胞的迁移能力、凋亡/坏死和细胞周期的影响。并从mRNA和蛋白水平探讨ATS对小鼠黑色素瘤B16细胞的作用机制。方法:1.运用CCK-8法检测ATS、DHA和Taxol单药对小鼠黑色素瘤B16细胞作用24h和48h的抑制作用,并计算IC50值;同时检测ATS联合Taxol三个配比AT(1:1)、AT(3:2)和AT(7:3)对小鼠黑色素瘤B16细胞作用48h的抑制作用,通过运用质量作用中效定理及药物合并指数定理进行分析,以及参考药物对细胞形态学的影响,分析两药联合用药是否有协同增效作用。2.通过划痕实验,观察 ATS(0.25、1 μ M)、Taxol(0.25、1 μ M)和两药联用(ATS0.175μ M+Taxol0.075 μ M、ATS0.7 μ M+Taxol0.3 μ M)作用小鼠黑色素瘤 B16 细胞 12h 和 24h,对细胞迁移的影响,并拍照记录。3.采用流式细胞术检测不同浓度ATS(0.25、1、5 μM)作用小鼠黑色素瘤B16细胞24h,对细胞凋亡/坏死和细胞周期的影响。4.通过荧光定量PCR检测不同浓度ATS(0.25、1、5 μM)作用小鼠黑色素瘤B16细胞24h后,对主要监测迁移能力的MMP-2/9基因,主要引起凋亡/坏死的RIP1/3、Fas/FasL、Caspase-3/8 基因,未复制 DNA 检测点的 ATR、Chk1、Cdc25C、CyclinB1、cdk1 基因以及 DNA 损伤检测点的 ATM、Chk2、p53、p21、Cdc25A、Wee1、CyclinD1/E1基因的mRNA表达量的变化。5.通过Western Blot法检测ATS(0.25、5 μM)作用小鼠黑色素瘤B16细胞24h后,CyclinB1、CylinD1、Wee1和Cdc25C蛋白的表达量的变化。结果:1.ATS、DHA和Taxol单药作用小鼠黑色素瘤B16细胞的IC50值,在24h时,分别为 126.56、86.09、3.27;在 48h 时,分别为 1.36、15.11、0.97μM。ATS 联合 Taxol三个浓度组AT(1:1)、AT(3:2)和AT(7:3)对小鼠黑色素瘤B16细胞作用48h,联合用药合并指数CI值均<1。2.划痕后ATS和Taxol单药作用以及联合给药作用12h和24h,与空白对照组比较,可以明显观察到,ATS0.25 μ M基本没有差别,而当剂量提高到ATS1 μM时,有一定的抑制小鼠黑色素瘤B16细胞迁移的作用,可见细胞迁移能力随着ATS浓度的升高而增加。Taxol无论浓度高低,抑制小鼠黑色素瘤B16细胞迁移的作用非常明显,界限清晰,细胞基本没有迁移。而联合用药组,ATS0.175 μ M+Taxol0.075 μ M、ATS0.7 μ M+Taxo10.3 μ M均表现出非常强的抑制小鼠黑色素瘤B16细胞迁移的作用。3.ATS(0.25、1、5 μM)作用小鼠黑色素瘤B16细胞24h后,根据Annexin-V-FITC流式细胞术检测的结果,与空白对照组相比,ATS低剂量组(0.25 μ M)对小鼠黑色素瘤B16细胞的凋亡/坏死作用不明显(P>0.05)。当ATS浓度大于1μM时,细胞早期凋亡不明显,但细胞晚期凋亡/坏死有显著性差异(P<0.001)。4.ATS(0.25、1、5 μM)作用于小鼠黑色素瘤B16细胞24h后,与空白对照组(0μM)相比,ATS组对小鼠黑色素瘤B16细胞周期有明显的周期阻滞作用。可以明显的看出,ATS作用后,细胞处于G0/G1期及G2/M期的比例明显增加,差异有统计学意义(P<0.001)。同时,细胞处于S期的比例明显减少,差异也有统计学意义(P<0.001)。并且随着ATS浓度的增加,作用强度增大。5.ATS(0.25、1、5 μM)作用小鼠黑色素瘤B16细胞24h发现,与空白对照组相比较,监测细胞迁移能力的MMP-9的mRNA表达量的下降不明显,而MMP-2的mRNA表达量显著下降。未复制DNA检测点检测结果显示:ATR、Chk1/2的mRNA表达量上升明显,Cdc25C、CyclinB1和cdk1的mRNA表达量下降明显。DNA损伤检测点检测结果显示,ATM、p53、p21、Wee1 的 mRNA 表达量上升明显,Cdc25A、CyclinE1/D1 的 mRNA表达量下降明显。6.ATS(0.25、5μM)作用小鼠黑色素瘤 B16 细胞 24h 发现,CylinD1、CylinB1和Cdc25c蛋白表达量随着ATS浓度的增加,显著下降。ATS(5 μM)与空白对照组相比较,有明显的统计学差异(P<0.01);而Wee1蛋白随着ATS浓度的增加,表达量显著上升,ATS5 μM与空白对照组相比较,有明显的统计学差异(P<0.001)。结论:1.ATS、DHA和Taxol单药对小鼠黑色素瘤B16细胞有明显的增殖抑制作用,随着药物浓度和时间的增加而明显增加,呈剂量-时间依赖性。而且青蒿琥酯联合紫杉醇抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖,有很好的协同增效作用。.2.ATS能有效的抑制小鼠黑色素瘤B16细胞的迁移能力,可能与MMP-2的表达量下降有关。3.ATS诱导小鼠黑色素瘤B16细胞发生后期凋亡,可能通过Fas/FasL途径,或者可能是通过RIP1激酶与FADD和Caspase-8形成复合物,传递TNF-α诱导凋亡信号。进而介导小鼠黑色素瘤B16细胞发生后期凋亡。4.ATS能使小鼠黑色素瘤B16细胞处于S期比例减少,处于G0/G1期和G2/M期的比例增多。对于未复制DNA检测点:可能通过激活ATR及下游的Chk1/2,使得Cdc25C的表达下降,导致CyclinB1-Cdk1形成的复合物减少,最终将细胞阻滞在G2/M期。对于DNA损伤检测点:在G1期到S期,可能通过激活ATM/ATR,使下游的p53和Chk1/2的表达增加,p53活化下游的p21,同时Chk1/2抑制下游Cdc25A的表达,使得CyclinD-Cdk4/6和CyclinE-Cdk2形成的复合物减少。在G2/M期,可能通过激活ATM/ATR及下游的Chk1/2,使得Cdc25C的表达下降,Wee1的表达上升,导致CyclinB1-Cdk1形成的复合物减少。