研究背景针刺可以兴奋不同神经纤维传入发挥镇痛作用。近期有研究记录正常大鼠L4-L5背根纤维放电情况,鉴别分析出手针刺激足三里穴可以激活Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV类躯体传入神经;另一研究则在家兔生理痛反射中研究针刺镇痛效应,发现针刺足三里穴兴奋的不同神经纤维类型对下颌反射均有抑制作用。针刺穴位产生针感,提示穴位深部的神经传入可能参与了针刺镇痛。当用普鲁卡因封闭受试者的合谷穴区深部肌神经传入后,其针感和镇痛效应很快消失,但封闭皮神经则没有影响,说明在肌肉丰满处针刺穴位可能是通过深部肌神经传导发挥作用。但是,疾病状态下,针刺穴位到底兴奋深部神经的哪一类纤维传入发挥镇痛作用,目前仍没有得到很好的阐释。近年来的外周局部镇痛机制新进展表明:深部神经弱的电刺激(兴奋A-纤维强度)能够有效缓解深部神经源性疼痛,这一结果为研究针刺穴位深部镇痛的外周机制提供了新思路。也为我们提出了新问题:深刺痛源局部穴位发挥镇痛效应的外周神经传入是如何参与针刺镇痛的?围绕这一科学问题,本研究采用行为学和外周神经纤维记录技术,探讨针刺“承山穴”的神经传入对局部肌肉炎性痛的镇痛作用。目的1明确深刺穴位肌肉神经传入在局部肌肉炎性痛中的镇痛作用。2阐明穴位肌肉神经传入缓解大鼠肌肉炎性痛的外周神经机制。方法1肌肉炎性痛模型制备与分组成年健康雄性SD大鼠(220±20g),异氟烷吸入麻醉状态下,在右侧腓肠肌注射完全弗氏佐剂(CFA)20ul/只,左侧腓肠肌注射同剂量的生理盐水作为对照,建立肌肉炎性痛模型。随机分为4组:对照组(CON组),完全弗氏佐剂组(CFA组),电针“承山穴”组(BL57 A-Stimu.组),蛇毒+电针“承山穴”组(venom+BL57 A-Stimu.组),每组动物不少于6只:用以研究针刺穴位外周神经纤维传入对深部肌肉炎性痛的镇痛效应及其机制。2刺激电极埋置与电针干预暴露支配承山穴区局部深层的腓肠肌,剪破腓肠肌肌膜并埋藏进双根银丝刺激电极。同时实现清醒状态下只刺激支配承山穴的深层肌肉而进行行为学动态监测;用刺激器在之前埋置好的电极上进行刺激,刺激强度为能够引起肌肉抖动,以兴奋更多支配肌肉的神经传入(A-纤维),在同一刺激参数下进行:频率10Hz和波宽0.2 ms(足以激活A-纤维电活动),强度15±5 V(足以使肌肉抖动),时间为10 min。3行为学检测3.1双足平衡痛觉测试用无创痛觉双足平衡仪测定动物站立时双侧后肢在压力传感器上的受力情况,正常大鼠左右后肢受力是平衡的,肌肉炎性痛侧受力明显减弱。测试前连续3天适应性训练,将大鼠放入透明塑料测试盒中,大鼠双足分别放在测试仪压力传感器面板上。控制面板上连续采集大鼠5s内的左、右各足体重分配值的平均值,将患侧肢体的值减去健侧肢体的值,得出相应的体重分配差异。3.2机械痛阈测试测试前将大鼠适应环境30 min,测痛阈时,匀速上升的金属探针穿过网眼垂直刺激大鼠足底后根部,当出现明显缩腿反应时,计时器计时停止,此时记录大鼠缩足潜伏期。分别采集双侧缩足潜伏期并计算差值取平均数。3.3热痛阈测试测试前将大鼠适应环境30 min,测痛阈时,将红外光源移至玻璃板下面,对准大鼠足底后根部,按下红外光发生器上的按钮,测试即开始,直到大鼠感觉到疼痛,便会缩回后爪,后爪缩回致使发热反射突然下降并切断红外光源,计时器计时停止,同样地记录大鼠缩足潜伏期。分别记录双侧缩足潜伏期并计算差值取平均数。3.4神经纤维电生理记录分离支配腓肠肌的胫神经干,利用皮瓣构筑油槽,灌注液体石蜡油,用游丝镊在石蜡油中分离神经细束,通过常规的电生理学技术记录,单极记录纤维的传入性放电,合格神经细束放电需满足A-纤维、C-纤维的单位放电特性。在拟分离的神经细束支配外周侧或感受野区安置刺激电极,根据电刺激记录到的神经纤维传导速度以及对自然刺激(如轻触、夹捏等)的反应来鉴定纤维的类型,能被轻触激活的神经纤维定义为A-纤维,传导速度1.5m/s的以下定为C-纤维。切断每一根被剥离的神经细束中枢端,外周端搭于记录电极上。Spike 2.0生物信息处理系统进行储存和分析。4统计分析计量资料以均值±标准误表示(X±SEM),组间分析用ANOVA再以Dunnet检验;计数资料以频数分布图表示,并进行正态性检验。数据用SPSS 17.0统计软件进行处理。P<O.05表示差异具有统计学意义。结果1大鼠肌肉炎性痛模型的确定在注射CFA前测定了正常大鼠(640次,n=16)双足负重,并将其双足差值进行频数分布统计描述,结果基本符合正态分布,双足负重差值为0.86±0.01 g,说明肌肉注射前的正常动物,双足负重没有统计学差异;而注射CFA(200μ1/rat)后的第1天起双足负重差值显著降低至-26.83±5.46g(P<0.001,n=6),之后6天持续出现明显的双足负重失衡，第7天其负重差值为-42.67±7.12 g(P<0.001),说明大鼠处于持续的肌肉慢性炎性痛状态。为验证肌肉注射CFA诱发的动物是否为炎性痛模型,采用经典的抗炎镇痛药吲哚美辛12 mg/kg灌胃观察其镇痛作用,结果显示1小时后便可观察到大鼠双足负重差值从-37.83±2.97 g增加到-15.67±5.71 g,且可持续4小时,说明吲哚美辛可以显著缓解肌肉炎性痛(P<0.01,n=6)。以上结果提示腓肠肌注射CFA可明显引起大鼠双足负重失衡,证明CFA引起的肌肉炎性痛模型建立成功。2电针“承山穴”缓解大鼠肌肉炎性痛2.1电针“承山穴”显著改善肌肉炎性痛大鼠的双足负重失衡电针2次后,其双足负重失衡行为得到显著缓解(-3.50±5.41g Vs 35.17±4.48 g,与CFA相比,P<0.001,n=6);随着刺激次数的增加可以产生持续的镇痛效果,到第7天,镇痛效果仍很显著(-7.83±3.83 g Vs-42.67±7.12 g,与CFA相比,P<0.001,n=6)。说明连续7天电针“承山穴”可明显缓解肌肉炎性痛,大鼠双足负重更接近正常状态。2.2电针“承山穴”缓解肌肉炎性痛大鼠体表痛觉过敏注射CFA后的第1天起,大鼠缩足反射潜伏期明显缩短,机械痛阈双足差值(-3.50±0.76 s Vs 0.12±0.15 s)和热痛阈双足差值(-3.39±0.74 s Vs0.12±0.14 s)出现显著性降低(P<0.001,n=6);提示肌肉炎性痛大鼠出现机械痛敏和热痛敏,且痛觉过敏状态至少持续1周(第7天机械痛阈-5.13±0.76 s和热痛阈-5.96±0.80s,P<0.001,n=6)。电针可以显著改善机械痛敏,连续7天电针显著升高大鼠双足热痛阈差值(与CFA相比,P<0.001或P<0.0],n=6),而对双足机械痛阈差值影响不明显(n=6);说明连续7天电针“承山穴”可以不同程度缓解大鼠痛觉过敏行为,且其对热痛敏的缓解作用明显。3电针“承山穴”抑制炎性痛肌肉C-纤维自发放电在正常大鼠支配正常肌肉的胫神经中分离出的C-纤维,测定其传导速度均小于1.0 m/s,这些纤维都没有自发放电(n=10)。而在肌肉炎性痛模型大鼠,在胫神经可以记录到大量的C-纤维紧张性传入放电,10 min内放电spikes为249±60(n=10)。在C-纤维自发放电的背景下,采用频率为10 Hz,波宽为0.2 ms(该波宽通常不能激活C-纤维),强度为15±5 V的电针“承山穴”肌肉,10min后,C-纤维自发放电spikes显著下降至72±29(与CFA相比,P<0.05,n=10)。说明电针“承山穴”肌肉可以抑制炎性痛肌肉C-纤维自发放电,这与电针缓解大鼠肌肉炎性痛行为学结果一致。4电针“承山穴”通过激活肌肉A-纤维传入缓解肌肉炎性痛4.1电针“承山穴”激活肌肉A-纤维传入电针穴位肌肉中来自肌梭的Ia纤维细束,兴奋了大量肌肉A-纤维传入;将记录到的纤维按照传导速度大小进行频数分布统计描述,神经纤维传导速度为5.59±0.67m/s(n=23)。根据其传导速度和对牵拉肌肉的反应,证明电针“7承山穴”至肌肉层激活的神经传入是A-纤维而几乎没有C-纤维的传入活动。4.2蛇毒阻断A-纤维后,电针“承山穴”抑制肌肉C-纤维自发放电的作用消失眼镜蛇蛇毒(0.15mg/rat)阻断A-纤维后,电针“承山穴”C-纤维自发放电 spikes 没有显著改变(10 min 内放电 spikes 266±85Vs236±90,P>0.05,n=1O)。提示电针的镇痛效应消失,是阻断“承山穴”肌肉A-纤维传入的结果,证明来自穴位肌肉的A-纤维传入是抑制肌肉C-纤维自发放电的原因。4.3蛇毒阻断A-纤维后,电针“承山穴”缓解肌肉炎性痛的作用消失阻断A-纤维后,电针前与电针过程双足负重差值分别为-29.00±2.30 g、-27.83±1.46g,没有显著性差异(P>0.05,n=7),提示蛇毒几乎完全阻断电针对肌肉炎性痛的缓解作用;用生理盐水代替蛇毒注射后,电针显著升高双足负重差值(-11.80±1.18 g Vs-26.10±1.04 g,P<0.001,n=7),提示生理盐水对电针镇痛效应没有影响。这部分实验结果与纤维记录结果一致。综合电生理学和行为学结果,证明电针通过激活“承山穴”肌肉A-纤维传入抑制C-纤维自发放电从而缓解大鼠肌肉炎性痛。结论电针通过激活穴位深部肌肉神经传入发挥缓解肌肉炎性痛作用;且A-纤维传入是穴位肌肉发挥治疗作用的外周神经机制。