本研究以无增殖能力的兔胚成纤维细胞为饲细胞，研究兔角膜缘干细胞在体外的增殖能力及其生物学鉴定；并以羊膜为载体将培养的自体角膜缘干细胞移植到角膜缘干细胞严重缺损的兔眼角膜上，并观察其效果。为干细胞移植这一具有发展前景的临床治疗方法提供实验依据。本研究分为两部分。 一　体外兔胚成纤维饲细胞克隆免角膜缘干细胞的实验研究 目的 了解经丝裂霉素C处理不同时间后的兔胚成纤维细胞的增殖能力，确定兔胚成纤维细胞为饲细胞的条件；了解兔角膜缘干细胞在经丝裂霉素C处理后的兔胚成纤维细胞作为饲细胞的培养条件下，干细胞克隆团的增殖情况，并探讨饲细胞的作用；对兔胚成纤维饲细胞层上形成克隆的兔角膜缘干细胞进行形态学和生物学活性鉴定。方法 采用常规方法培养兔胚成纤维细胞，同时用10μg／ml丝裂霉素C处理不同时间后，观察不同条件下细胞形态学特征及数量；将兔角膜缘干细胞消化下来，分别接种于经丝裂霉素C处理后的兔胚成纤维细胞，观察各组干细胞克隆形成率(CFE)，同时对比有饲细胞层的兔角膜缘干细胞和无饲细胞层的兔角膜缘干细胞克隆形成率(CFE)在原代培养和传一、二、三代培养中各组的差别；观察兔角膜缘干细胞克隆团光镜特征、电镜超微结构，间接免疫细胞化学染色观察AE1、AE5、PCNA单克隆抗体免疫反应等对克隆的干细胞进行形态学和生物学活性鉴定。结果 兔胚成纤维细胞能长期传代，细胞形态均一，呈梭形，易于分辨。而经10μg／ml丝裂霉素C处理2.5h的兔胚成纤维细胞，形态虽然仍均一，呈梭形，但培养期间细胞数量没有变化；接种于经丝裂霉素C处理的兔胚成纤维的兔角膜缘干细胞3～4天后开始形成单个克隆，克隆团中细胞数为4个以上，5～6天克隆团中细胞数明显增加，10～12天克隆团不断向周围扩张并形成单层。有饲细胞层的兔角膜缘干细胞的平均克安徽医科大学硕士学位论文隆形成率(cFE)在原代培养和传一、二、三代培养中分别为11.51士l，27%、10.50士1.27%、10.31士103%、9.33士0.%%;而无饲细胞层的兔角膜缘干细胞的平均克隆形成率(CFE)分别为1 0.16士0.68%、6.73士0，69%、2.67士0.95%、0.90士0.19;克隆的细胞呈典型的上皮细胞形态，电镜下可见微绒毛、桥粒、张力丝等典型上皮细胞结构，单克隆抗体AEI、PCNA染色后细胞大多数呈阳性，单克隆抗体AES染色后细胞染色偶见阳性。结论兔胚成纤维细胞经10件g/m1丝裂霉素C处理2.5h后仍能存活，但无增殖能力，适合作为兔角膜缘干细胞的培养的饲细胞;以丝裂霉素C处理的兔胚成纤维细胞为饲细胞有助于维持兔角膜缘干细胞的高增殖性;体外兔胚成纤维细胞为饲养层成功地克隆出兔角膜缘干细胞，克隆的细胞既保持角膜上皮细胞特性，又具有强的增殖潜力。二兔角膜缘干细胞自体移植的实验研究 目的观察以羊膜为载体的兔角膜缘干细胞膜片移植治疗兔角膜缘干细胞缺 损的效果。方法制造兔角膜缘干细胞缺损的动物模型，以右眼为实验眼，从 兔左眼取角膜缘组织，将兔角膜缘干细胞消化下来，接种于含有经丝裂霉素C 处理后的兔胚成纤维细胞上，当细胞层密度达80%一90%汇合时进行消化传代， 按1 xl以个细胞/mmZ面积接种于铺有羊膜的无菌六孔培养板中，待细胞形成多 层角膜上皮细胞后，对日本大耳白兔角膜缘干细胞缺损动物模型行角膜缘干细 胞羊膜移植术，并对治疗后的角膜进行裂隙灯及病理学检查。结果体外培养 的兔角膜缘干细胞可在羊膜上继续增殖、分化为多层角膜上皮细胞;角膜缘干 细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血 管减少或消失。临床和组织病理学染色证实:角膜缘及其周边上皮细胞为多层 结构，角膜新生血管消失及基质中炎性细胞浸润减轻。结论角膜缘干细胞羊 膜移植术治疗角膜可恢复其角膜上皮结构的完整性，减少角膜新生血管的形 成，维持角膜缘的细胞屏障功能。