结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis,M. tuberculosis）细胞壁具有独特的结构,其中聚阿拉伯糖是细胞壁的重要组成成分。临床一线抗结核药物乙胺丁醇（Ethambutol,EMB）能引起结核分枝杆菌细胞壁聚阿拉伯糖大量减少,但其作用的直接靶点目前尚不清楚。本论文在前期蛋白组学研究工作基础上结合基因芯片数据分析,发现聚十异戊二烯磷酸阿拉伯糖（Decaprenyl-phospho-arabinose, DPA）代谢途径与EMB作用密切相关,并且推测一个未知功能蛋白Rv3807c参与了DPA的合成途径。生物信息学功能分析显示Rv3807c具有磷酸酶活性,可能催化DPA合成过程中的脱磷酸反应。由于无法制备特异性底物来测定Rv3807c的磷酸酶活性,为了阐明Rv3807c与DPA合成途径之间的关系,探索EMB作用的新靶点,本研究利用与结核分枝杆菌具有相同遗传学特性,但无致病性的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis mc2155）作为模式菌,建立MSMEG₆402（MSMEG₆402是Rv3807c在mc2155菌株中的同源蛋白）基因敲除菌株,揭示MSMEG₆402与结核分枝杆菌细胞壁代谢的关系,为完善DPA合成途径和分枝杆菌细胞壁代谢研究奠定基础。首先,本研究利用SAM（Significance analysis of microarray）分析软件对GEO数据库中GSE1642基因芯片数据进行统计学处理和聚类分析,建立EMB处理后结核分枝杆菌基因差异表达谱。其次,利用RT-PCR方法检测了DPA合成相关基因（IspF和IspD）在Rv3807c过表达mc2155菌株中的表达变化趋势。最后,利用同源重组方法建立MSMEG₆402基因敲除菌株并进一步对其生物学功能变化进行分析。为建立MSMEG₆402基因敲除菌株,首先将MSMEG₆402及KanR与pPR27-xylE载体连接构建重组体,获得条件性复制质粒pPR27-xylE-MSMEG₆402:: kanR（pXYⅠ）。该质粒在39℃以上温度下不能复制,所以,转化菌株在42℃条件下培养,迫使pXY1质粒与mc2155菌株基因组DNA发生同源重组,使pXYⅠ质粒整合到mc2155基因组DNA中。利用能产生黄色产物的xylE基因筛选重组菌落,进一步利用PCR分析和Southern blotting杂交鉴定正确位置的第一次同源重组菌株,命名为M.sm-pXYI。其次,将Rv3807c基因被克隆到pCG76-Phsp60质粒中构建了营救质粒pCG76-Phsp60-Tb-Rv3807c（pXYⅡ）,并将其转化到M.sm-pXYI感受态中,利用含10%蔗糖的选择性LB培养基在30℃条件下进行压力筛选,使M.sm-pXYI菌株基因组内部发生第二次同源重组。通过第二次同源重组将mc2155基因组内MSEGE₆402基因置换成失活的MSMEG₆402::KanR。利用PCR及PCR产物序列测定方法筛选MSMEG₆402基因敲除突变菌株,被命名为M.sm-ΔM-₆402。为进一步了解MSMEG₆402功能,利用M.sm-ΔM₆402从以下六个方面分析突变菌株生物学功能变化。（1）以野生型mc2155菌株和转化营救质粒的mc2155菌株为对照,每隔24 h检测M.sm-ΔM₆402菌株在600nm波长下的吸光度值,绘制30℃和42℃条件下生长曲线。（2）利用MTT方法检测M.sm-ΔM₆402菌株对一线抗结核药物-乙胺丁醇（Ethambutol ,EMB）的敏感性。（3）M.sm-ΔM₆402菌株分别在30℃和42℃条件下培养,应用JSM-6360LV扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy ,SEM）观察M.sm-ΔM₆402基因敲除菌株在MSMEG₆402基因功能缺失和补偿不同条件下的细菌形态变化。（4）当mc2155、M.sm-ΔM₆402以及EMB处理的mc2155细菌生长到对数生长期时利用JEM-2000EX透射电子显微镜（Transmission electron microscopy ,TEM）观察细菌细胞壁超微结构变化。（5）提取野生型mc2155、M.sm-ΔM₆402和EMB处理的mc2155细菌细胞壁聚阿拉伯糖半乳糖（Arabinogalactan,AG）成分,以阿拉伯糖和半乳糖标准品（Biosharp公司）出峰时间为参照,利用高效液相色谱分析AG中阿拉伯糖和半乳糖含量比值变化。（6）采用RT-PCR方法检测阿拉伯糖代谢相关基因的表达变化趋势。基因芯片分析结果表明:EMB作用结核分枝杆菌后引起Rv3807c基因表达下调,与已知DPA合成相关基因表达变化趋势一致,本实验进一步研究发现:EMB处理耻垢分支杆菌后,同样可见MSMEG₆402基因表达呈下调趋势变化。RT-PCR研究表明:Rv3807c过表达后引起mc2155细菌中DPA合成相关基因IspF和IspD表达呈上调趋势。另外,我们成功构建条件性复制质粒和营救质粒,并利用两次同源基因重组筛选到MSMEG₆402基因敲除菌株（M.sm-ΔM₆402）。对于第一次同源重组,利用PCR和Southern blotting鉴定结果表明:40个筛选克隆中有2个克隆在正确位置发生了第一次同源重组;利用PCR鉴定第二次同源重组结果表明:3个克隆扩增出了预测大小的PCR条带,通过PCR产物序列测定后进一步证明了该3个克隆为真正在基因组内部发生插入性失活的MSMEG₆402基因敲除菌株,因此,我们成功筛选到MSMEG₆402基因敲除菌株。并从以下五个方面分析MSMEG₆402蛋白相关功能:（1）从生长曲线可知,MSMEG₆402功能缺失后,细菌生长滞后,该抑制作用在生长对数初期较明显,但未见细菌生长完全抑制现象,所以,该基因为耻垢分支杆菌生长非必需基因。（2）相同浓度的EMB处理后,M.sm-ΔM₆402突变菌株的生长抑制作用强于野生型mc2155菌株,所以M.sm-ΔM₆402突变菌株对EMB的敏感性增强。（3）MSMEG₆402功能缺失后,菌体形态和细胞壁结构均发生明显变化,菌体表面粗糙且发现细菌死亡碎片;细胞壁结构厚薄不均,扭曲变形,所以,MSMEG₆402功能与耻垢分支杆菌细胞壁代谢密切相关。但MSMEG₆402功能缺失并没有引起EMB处理后的细胞壁严重损伤等变化。（4）HPLC结果表明:野生型mc2155菌株、M.sm-ΔM₆402突变菌株与EMB处理的mc2155菌株细胞壁AG中阿拉伯糖与半乳糖含量比值分别为2.1、1.7和1.1。从以上结果可见:EMB处理后mc2155细胞壁阿拉伯糖含量大量流失,MSMEG₆402功能缺失亦引起阿拉伯糖含量降低。该研究结果表明MSMEG₆402的功能与细胞壁阿拉伯糖代谢有关。（5）参与SAM合成的关键基因（metK）在M.sm-ΔM₆402菌株中表达明显降低,MSMEG₆402可能间接影响菌体内甲基化过程。综上所述,MSMEG₆402为耻垢分枝杆菌生长非必需基因, MSMEG₆402功能缺失后,细胞壁AG中阿拉伯糖含量减少,耻垢分枝杆菌细胞壁和细菌形态均出现明显变化,并伴随有细菌生长滞后等改变。这些结果均表明:MSMEG₆402影响了细胞壁聚阿拉伯糖代谢,推测该作用可能是直接或间接参与了DPA合成途径所引起,但仍需特异性磷酸酶活性分析来证明。