小麦(Triticum aestivum L.)高分子量麦谷蛋白1By15和1Dx1.5基因高效表达载体的构建及转化研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:loveshdou
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本文在已克隆该亚基编码基因的基础上,从基因调控入手,研究Glu-1By15基因在种子发育过程中的表达变化规律,克隆和筛选胚乳特异表达的强启动子,构建载体,并进行小麦转化,为用分子手段进行小麦品质改良提供技术和科学依据。 对1Bx14+1By15携带者小偃54、小偃6号、陕优225和偃展1号籽粒HMW-GS蛋白和RNA进行提取和定量,发现无论翻译水平还是转录水平Glu-1Bx14的表达要明显高于Glu-1By15,并且在品种间存在一定的差异。对陕优225和小偃54两个品种中1By15基因组织和发育时间的表达特异性研究发现,Glu-1By15仅在胚乳发育特定时期表达,并且表达阶段和表达峰值在品种间存在差异。 根据已知的序列特征,用PCR法克隆了1By15的部分启动子序列,并克隆了1Bx14,1By8,1Dx2和1Dy12等基因的启动子。序列分析表明HMW-GS基因的启动子序列同源性较高,都具有典型的HMW-GS基因启动子的序列特征,发现1Bx14的启动子序列具有明显的特异性。在启动子的瞬时转化实验中,它们操纵GUS基因表达的水平与其所操纵的结构基因(HMW-GS基因)表达水平结果相一致,即1By15的启动子活性低于1Bx14子的启动。此外我们还得到了能启动GUS强表达的Glu-1Dx2基因的启动子P2。 从烟草和水稻中成功克隆了两个已知的基质序列(MARs)。瞬时表达实验表明,仅在基因表达盒前侧加入MARs不能发挥其促进基因转录表达的作用,反而可能会对基因表达起到抑制作用。 利用内源强启动子P2(Glu-1Dx2基因的启动子)和MARs序列构建了1By15和1Dx1.5t基因的高效表达载体,用基因枪法和花粉管通道法进行了小麦转化研究。在对1By15的基因枪法转化中,共转化质粒pUC-MT2-15和pACH20的转化效率明显高于pCAB2-15。Southern杂交证明有4个转基因品系(T0)有1By15基因的插入;SDS-PAGE检测到6个T1株系中目的蛋白成功表达。 通过花粉管通道法进行1By15的转化,只有pCAB2-15载体得到了56个PCR检测为阳性的独立株系。Southern杂交证明有2个转基因品系(T1)有1By15基因的插入;经SDS-PAGE检测有6粒(T2)种子得到了目的蛋白的表达。发现该基因的导入可能干扰了受体品种原有种子蛋白基因的表达,但Western杂交分析证明,转化籽粒低分子量区出现的一些未知蛋白(可能)并不是高分子量谷蛋白的变异体。 对于1Dx1.5t基因的转化,PCR初步鉴定表明基因枪法转化率平均为1.9%。
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