一、目的： 通过考察哌罗匹隆对P-糖蛋白功能和表达的影响、P-糖蛋白与哌罗匹隆的亲和力以及P-糖蛋白对哌罗匹隆跨膜转运的影响，探讨药物与P-糖蛋白的相互作用。 二、方法： 1.细胞培养及毒性试验Caco-2细胞和ECV304细胞均采用DMEM高糖培养基进行常规培养，细胞免疫荧光法进行P-糖蛋白表达验证。 用MTT法分别考察哌罗匹隆和维拉帕米对Caco-2细胞及ECV304细胞的毒性，选择细胞存活率大于90％的药物浓度作为最大无毒浓度进行下一步细胞实验。 2.哌罗匹隆对P-糖蛋白功能的影响用流式细胞仪测定细胞内荧光强度，考察哌罗匹隆对P-糖蛋白介导的罗丹明123外排作用的影响，从而判断药物对P-糖蛋白的功能有何影响。 3.哌罗匹隆对P-糖蛋白表达的影响药物与细胞作用72小时后采用RT-PCR技术分析哌罗匹隆对Caco-2细胞上MDRl基因mRNA表达水平的影响；用流式细胞术分析哌罗匹隆对Caco-2细胞上P-糖蛋白表达影响。 4 哌罗匹隆与P-糖蛋白的体外亲和力P-糖蛋白是利用细胞内ATP酶水解释放的能量将其底物泵出细胞，采用磷钼蓝法测定0.01-100gmol/L哌罗匹隆与P-糖蛋白膜共孵育时ATP酶活性变化，用米.曼式方程计算Vmax、Km、’Vmax/Km，得到药物与P-糖蛋白的体外亲和力。 5 P-糖蛋白对哌罗匹隆转运的影响首先建立LTPLC-MS/MS测定哌罗匹隆的方法。 在建立好的Transwell单层细胞模型上研究哌罗匹隆双向跨膜转运，考察P-糖蛋白功能改变前后哌罗匹隆转运的差异。用UPLC-MS/MS测定样品的药物浓度，计算表观渗透系数。 三、结果： 1.细胞培养及细胞毒性实验Caco-2细胞和ECV304细胞在正常条件下生长旺盛，Caco-2细胞高表达P-糖蛋白，适合哌罗匹隆与P-糖蛋白相互作用研究用；对照细胞ECV304低表达P-糖蛋白，适合作阴性对照。 MTT结果显示哌罗匹隆对Caco-2细胞的最大无毒浓度为30μmol/L，维拉帕米在0.01-100Wnol/L浓度内对Caco-2细胞没有毒性。2种化合物在0.01-100μmol/L浓度内对ECV304细胞无明显毒性。因此确定哌罗匹隆系列浓度为0.01、0.1、1、10、30μmol/L，维拉帕米系列浓度为0.01、0.1、1、10、30、50μmol/L。 2.哌罗匹隆对P-糖蛋白功能的影响0.01-30gmol/L哌罗匹隆对P-糖蛋白介导的罗丹明123外排有显著抑制作用(P<0.05)，且呈剂量依赖性，30gmol/L哌罗匹隆使细胞内荧光强度增加429％。 3.哌罗匹隆对P-糖蛋白表达的影响在mRNA水平上：RT-PCR结果显示0.01-30μmol/L哌罗匹隆组的目的条带总灰度值与内参总灰度值之比小于阴性组和阳性对照组(P<0.05)，哌罗匹隆对Caco-2细胞的MDR1基因mRNA表达水平有下调作用。 在蛋白水平上：在0.01-30μmol/L范围内，哌罗匹隆组荧光强度明显低于阴性对照组(P<0.05)，哌罗匹隆能显著降低Caco-2细胞上P-糖蛋白的表达，30μmol/L药物作用72小时后，P-糖蛋白表达量仅为阴性对照组的10％左右。 4 哌罗匹隆与P-糖蛋白的体外亲和力相同浓度下，P-糖蛋白与药物作用时间越长，ATP被水解后释放的无机磷量越多；相同作用时间下，药物浓度越高，ATP被水解后释放的无机磷量越多；哌罗匹隆与P-糖蛋白亲和力(Vmax/Km:1.3)小于维拉帕米与P-糖蛋白的亲和力(Vmax//Km:2.6)。 5 P-糖蛋白对哌罗匹隆转运的影响未加入P-糖蛋白抑制剂维拉帕米时，低浓度(0.01μmol/L)哌罗匹隆的双向转运无明显差异(P>0.05)，中(1μmol/L)、高(30μmol/L)浓度B→A转运程度高于A→B转运；与维拉帕米共同作用时，3个浓度的双向转运均无显著性差异(P>0.05)，说明P-糖蛋白在一定程度上参与了哌罗匹隆的跨膜转运，当其功能受到抑制时，药物外排减少。 四、结论： 1.哌罗匹隆对P-糖蛋白具有瞬时的功能抑制作用和72小时的表达下调作用，提示临床上哌罗匹隆与P-糖蛋白底物药合用时，可能会有药物相互作用发生，哌罗匹隆可能会增加P-糖蛋白底物药在细胞内的浓度，从而增加疗效或使毒性作用更强。 2.哌罗匹隆与P-糖蛋白亲和力不高，P-糖蛋白参与较高浓度哌罗匹隆转运，但对低浓度哌罗匹隆的跨膜转运无明显影响，其作为P-糖蛋白底物特征不明显，需进一步研究证实。