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[目的]外伤性视神经病变(Traumatic optic neuropathy,TON)是机械性视神经损伤的常见病因,早期直接的病理损伤是导致神经元和神经胶质细胞死亡的主要原因。TON引起的神经二次退行主要体现在炎性反应后期视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGCs)的持续性凋亡。研究表明中枢神经系统(central nervous system,CNS)机械性损伤能够激活内源性自身免疫T细胞类群,引起创伤诱导的自身免疫(Trauma-induced autoimmunity,TIA)。目前针对TIA在机体损伤修复中扮演的作用尚存在较大争议,但越来越多的人认为TIA在维持CNS稳态和损伤修复中扮演着关键的作用。有研究认为自身反应性T细胞不仅能够引发和维持CNS中的病理进程,也能够参与受损神经的修复和再生过程,发挥保护性作用。然而,目前尚不清楚适应性自身免疫反应如何参与TON病理过程,相关免疫细胞的活化状态如何?参与神经损伤或修复过程?本研究通过视神经横断术以模拟机械性视神经损伤引起的急性轴突变性(acute axonal degeneration,AAD),探索自身反应性T细胞是否参与了视神经损伤过程。同期使用抗原分子感光细胞间维生素A类结合蛋白(Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein,IRBP)对C57BL/6小鼠进行皮下免疫,明确自身反应性T细胞是参与炎症还是修复?以及是哪一类特异性自身反应T细胞其亚群参与其中?发挥了怎样的作用?明确自身反应T细胞类群在TON中的作用机制,对进一步阐明TON的病理机制以及寻找潜在的治疗手段具有潜在的临床意义。[方法]选用同性别同年龄段C57BL/6小鼠,将小鼠分为假手术组、视神经横断组以及免疫后视神经横断组三组,假手术组作为对照组。视神经横断后,选择7天、14天、28天三个时间点进行观察,每组每个时间点选用小鼠10只,雌雄各5只。视神经横断组进行单纯的视神经横断手术以建立机械性视神经损伤模型。造模完成后,分别在特定时间点处死小鼠,取小鼠眼球及视神经并固定,进行冰冻切片,切片后保存。通过苏木素伊红(Haematoxylin-eosin,HE)染色、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色观察RGC并计数,通过免疫荧光染色观察固有免疫反应以及观察视网膜及视神经内是否产生T细胞。在特定时间点无菌取小鼠脾脏,分离淋巴细胞并冻存,利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测损伤前后淋巴细胞类群,即效应T细胞(effector T cells,Teff)及调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的变化。同时通过免疫酶联斑点技术(Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测损伤前后特异性 T 细胞类群。此外,通过主动免疫小鼠自身抗原特异性T细胞表位IRBP,流式分析免疫后淋巴细胞(Teff及Treg)类群变化并确认每个T细胞类群变化高峰,在T细胞变化的最佳时间进行小鼠视神经横断模型的建立,即免疫后视神经横断组。成功建模后,在损伤特定时间处死小鼠并取眼球,对免疫后视神经横断的RGC数量与单纯横断视神经的RGC数量进行比较,判断自身反应性T细胞是否减少RGC凋亡。进行抑炎因子IL-10以及脑源性神经营养因子BDNF的免疫荧光染色来分析自身反应性T细胞存在的情况下,对机械性视神经损伤是否具有保护性作用。[结果]视神经横断后,手术部位无出血,眼睛无肿胀突出,眼睛大小无改变,无晶状体变色,无并发感染。通过优化手术方法,手术成功率显著提高,经fisher精确检验,手术优化后出血率降低具有显著的统计学差异(P<0.05)。视网膜HE染色结果显示,视神经横断组视网膜神经节细胞层RGC与对照组比较,RGC数量明显减少,细胞核大小不一,细胞分布不均匀,细胞排列紊乱,且内核层变薄。免疫荧光染色显示,损伤后RGC在不同时间点计数,与对照眼相比,视神经横断组RGC减少具有显著的统计学差异(P<0.05)。视神经横断后视网膜产生了激活的小胶质细胞和星形胶质细胞。视神经横断组的视神经及眼内出现荧光标记的T淋巴细胞,而对照组视神经及眼内则没有出现。视神经横断后,流式细胞术检测淋巴细胞类群结果显示,Teff中的Th1在各时间点均有所增加,在14天及28天时间点均显著增加(P<0.05)。而Th2与对照组相比无明显变化(P>0.05)。Treg有所减少,在14天及28天时间点均显著减少(P<0.05)。Elispot结果显示,在视神经横断后特异性自身反应T细胞(Th1)增加不明显,仅在28天时间点增加具有统计学意义(P<0.05)。而Th2与对照组相比无明显变化(P>0.05)。通过注射特异性自身抗原表位刺激小鼠,流式细胞术检测淋巴细胞类群变化结果显示,Teff中的Th1在各时间点均有所增加,在抗原免疫后各个时间点均有显著增加(P<0.05),在抗原免疫后7天时间点增加最为明显(P<0.01)。而Th2与对照组相比无明显变化(P>0.05)。Treg在各个时间点均显著减少(P<0.01)。Elispot结果显示,在免疫抗原后特异性自身反应T细胞(Th1)在各个时间点均明显增加(P<0.05),在抗原免疫后7天,Th1增加最为显著(P<0.01)。而Th2与对照组相比无明显变化(P>0.05)。通过免疫荧光染色结果显示,抗原免疫后7天的小鼠视网膜周围相比与单纯视神经横断的小鼠视网膜周围出现了更多的CD4+T细胞的浸润(P<0.05)。通过计数抗原免疫后小鼠RGC数量与对照组进行比较,结果表明注射特异性抗原不会影响小鼠RGC数量(P>0.05)。所以,接下来选择特异性抗原免疫7天后的小鼠进行视神经横断,在7天,14天,28天特定时间点进行RGC计数,通过与单纯视神经横断小鼠RGC数量比较,发现在自身反应性T细胞存在下,视神经横断后RGC凋亡并未减少(P>0.05)。通过免疫荧光染色结果显示,在特异性抗原免疫过的小鼠进行视神经横断后,各时间点视网膜附近均未发现抑炎因子IL-10及脑源性神经营养BDNF的表达。[结论]1.在C57BL/6小鼠视神经横断模型中发生了适应性免疫反应,自身反应性T细胞浸润至视网膜周围及视神经内,并出现了 Th1/Treg 比例失衡,但特异性反应较弱。2.特异性自身抗原免疫后增强了自身反应性T细胞(Teff中的Th1)的激活,加剧了 Th1/Treg失衡。并发现CD4+Tcell从视网膜周围向视网膜内浸润。3.激活的自身反应性Th1可能引发慢性炎症参与了后续的二次退行性病变。自身反应性Treg活化不充分导致的Th1/Treg失衡及慢性炎症可能是视神经修复的主要障碍。