【摘 要】
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目的:从生物细胞及分子层面进行实验以验证Rho激酶（Rho-Associated Coiled-Coil Containing Protein Kinase,ROCK2）与冠心病猝死（Sudden Coronary Death,SCD）的关联性,为冠心病猝死的预测指标提供新参考。方法:通过脂质体转染,使小鼠冠状动脉平滑肌细胞（Coronary Vascular Smooth Muscle cell
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目的:从生物细胞及分子层面进行实验以验证Rho激酶（Rho-Associated Coiled-Coil Containing Protein Kinase,ROCK2）与冠心病猝死（Sudden Coronary Death,SCD）的关联性,为冠心病猝死的预测指标提供新参考。方法:通过脂质体转染,使小鼠冠状动脉平滑肌细胞（Coronary Vascular Smooth Muscle cells,CVSMc）表达小鼠增强型绿色荧光蛋白标记的ROCK2蛋白（EGFP-m ROCK）,以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）的表达指示ROCK2的表达。之后,构建SCD细胞模型,利用超分辨荧光显微镜实时、定性、定位监测对照组、转染组、冠心病组、冠心病猝死组、Slx-2119（ROCK2特异性抑制剂）组的ROCK2的蛋白表达及细胞收缩情况,再用全能细胞仪检测ROCK2对SCD细胞模型中细胞凋亡的影响。此外,在冠心病猝死细胞模型的分子层面定量检测,分为对照组、冠心病组、冠心病猝死组、Slx-2119抑制剂组,通过实时荧光定量PCR（Real Time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR）检测ROCK2 m RNA的表达及蛋白印记法（Western Blot,WB）检测ROCK2表达。结果:（1）转染后小鼠CVSMc可正常表达绿色荧光蛋白标记的ROCK2（EGFP-ROCK2）;并且荧光显微镜下转染12 h内小鼠CVSMc表达EGFP-ROCK的量,随时间延长缓慢增加。（2）用单核巨噬细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）（10 ng/m L）干预CVSMc 24 h内,2 h时组织因子（Tissue factor,TF）的m RNA相对表达量高于其他组（P<0.05）,成功构建冠心病细胞模型。用MCP-1（10 ng/m L）干预CVSMc 2 h后,取不同浓度血管紧张素Ⅱ（Angiotensin II,AT-Ⅱ）继续作用1 h,在AT-Ⅱ为0.1μM时,ROCK2的m RNA相对表达量高于其他组（P<0.05）。接着,用MCP-1（10 ng/m L）干预2 h后,AT-Ⅱ0.1μM干预CVSMc,6 h内（0 h、1 h、3 h、6 h）,1 h和3 h时ROCK2的m RNA相对表达量高于对照组（P<0.05）,二者间表达无明显统计学差异（P>0.05）,建立了冠心病猝死细胞模型。之后,转染12 h内,测得不同时间组,ROCK2的m RNA相对表达量逐渐增加（P<0.05）。但在转染CVSMc8 h时,用MCP-1（10 ng/m L）干预2 h,AT-Ⅱ0.1μM干预1 h,测得ROCK2的m RNA相对表达量明显增加（P<0.05）。（3）超分辨荧光显微镜下,定位、实时、定性:监测冠心病猝死细胞模型中,ROCK2的表达量高于空白对照组及冠心病组;同时,细胞收缩,体积变小,梭型及三角形细胞增多。（4）与对照组相比,冠心病组和SCD组细胞模型中细胞凋亡增加,Pearson卡方值分别为12.144、93.377,P<0.05。与冠心病组相比,SCD细胞模型中细胞凋亡增加,Pearson卡方值为40.659,P<0.05。对照组与SLX-2119（ROCK2特异性抑制剂组）相比,细胞凋亡无明显统计学差异,P>0.05。（5）分子层面定量检测:与对照组相比,冠心病组及SCD组中,ROCK2 m RNA相对表达量增加,P<0.05;ROCK2/GAPDH灰度值增加,P<0.05。SCD组与冠心病及SLx-2119抑制剂组相比,ROCK2 m RNA相对表达量增加,P<0.05;ROCK2/GAPDH灰度值增加,P<0.05。SLx-2119抑制剂组与对照组相比,ROCK2 m RNA相对表达量及ROCK2/GAPDH灰度值无明显统计学差别,P>0.05。结论:在冠心病猝死细胞模型及其分子水平,ROCK2的表达异常增加;ROCK2作为冠脉痉挛的核心要素,是引起冠心病猝死细胞凋亡的主要关键,也是导致冠心病猝死的重要原因。
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