北虫草固体培养残基中多糖和虫草素高效提取与纯化研究

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北虫草(Cordyceps militaris (L.Fr.)Link),又名北冬虫夏草、蛹虫草,是一类传统的滋补中药材,与著名的中药冬虫夏草有相似的药理活性。北虫草有增强免疫、抗肿瘤、抗疲劳等功效,具有较高的药用价值,深受消费者喜爱。北虫草目前已实现了人工培养,包括液体培养和固体培养两种方式。当前大多数工厂化生产北虫草的企业都是采用固体培养的方式。北虫草收扶后,其残余固体培养基中仍富含菌丝,含有多种有效成分,如虫草多糖、虫草素等,但并没有成熟的工艺对其中的有效成分进行提取分离。目前,规模化人工培养北虫草所产生的大量废弃培养料没有得到很好的利用,不仅造成资源的浪费,也对环境造成危害。本研究选择北虫草固体培养残基为原料,采用闪式提取法对培养残基中多糖的提取工艺进行了优化,同时研究了北虫草固体培养残基中虫草素的超高压提取、膜分离及高速逆流色谱纯化工艺,期望为全面开发利用北虫草培养残基提供一定的理论依据。主要研究结果如下:1.为了避免北虫草固体培养残基中的淀粉对虫草多糖含量测定结果的干扰,研究了α-淀粉酶不同酶解温度、酶解pH、酶添加量和酶解时间对淀粉去除的影响。结果表明,α-淀粉酶在pH6.0、料酶比为50:1、温度为60℃的条件下酶解180min时还原糖释放量趋于稳定,碘液检测无蓝色出现,即在此条件下可将北虫草固体培养残基的多糖提取液中淀粉去除。2.采用热水回流提取北虫草培养基中多糖,在料液比1:30,90℃条件下回流3h得到提取液,对提取液中不加入α-淀粉酶和加入a-淀粉酶进行了比较,结果发现,不加α-淀粉酶的多糖得率为8.42%,加α-淀粉酶的多糖得率为3.48%不加α-淀粉酶的多糖得率是加α-淀粉酶的2.42倍,不添加α-淀粉酶去除样品中的淀粉将造成多糖得率虚高,使得到的结果不准确,因此,需添加α-淀粉酶排除虫草多糖测定时淀粉的干扰,为下一步实验的顺利进行奠定了基础。3.采用闪式提取对北虫草培养基中多糖进行提取,研究了液料比、提取时间、转速对虫草多糖提取的影响,并利用正交试验法对工艺参数进行优化。结果表明,影响北虫草培养基中多糖闪式提取的各因素的主次顺序是转速影响最大,其次是提取时间,影响最小的是液料比。方差分析可知,闪式提取的提取时间和转速对北虫草培养基中多糖提取具有显著影响。北虫草培养基中多糖的最佳提取工艺条件为:液料比35:1,提取时间12 min,转速8000 r/min,在此条件下得到的多糖得率为3.52%。与热水回流提取相比,闪式提取多糖得率略高,只需在室温下进行,有效避免了长时间高温提取对多糖结构的破坏,且提取时间由3h缩短为12mmin,节省了能耗,提高了效率。4.采用超高压法提取北虫草培养基中虫草素,研究了超高压压力、提取时间、料液比、粉碎度和提取次数对虫草素提取率的影响。通过PB实验设计筛选影响虫草素提取率的显著因素。结果表明,超高压压力为400 MPa、提取时间为12 min、料液比为70:1、粉碎度为20目、提取次数为2次时提取虫草素较好。通过PB实验设计,虫草素得率一阶回归模型的拟合度(R2=88.84%)较好,提取次数对虫草素得率的影响显著。研究显示超高压提取虫草素优于超声波提取,具有高效节能环保的优势。5.采用陶瓷膜对超高压提取液进行过滤除杂,结果表明,提取液中虫草素含量由44.86%提高到49.56%,除去了大部分杂质为后续高速逆流色谱(HSCCC)纯化减少了难度。利用HSCCC对虫草素粗提物进行分离纯化,且对虫草素分离的溶剂体系进行了筛选,得到最佳溶剂体系是:乙酸乙酯/正丁醇/水体系(2:3:5,V/V)。在此体系下的固定相保留率为52.7%,分离时间少于3h,分离效果良好,虫草素纯度达到97.6%,是一种富集纯化虫草素的可行有效的方法。
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