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疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的嗜热真菌,是真核生物中生长上限温度最高的一种真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,并进行了真核表达,使得该菌种在工、农业生产和微生物研究中的作用越来越大。目前,对该嗜热菌感受和传导信号的机制尚不清楚。通过遗传转化,向菌株基因组随机插入外源质粒DNA,构建该菌的突变体,对探索该菌的嗜热性机制具有重要意义。此外,遗传转化体系的构建为研究基因的功能,分离功能基因提供了重要的手段,也为外源基因在其体内的表达提供了有效地途径。农杆菌介导的转化因其优点众多而得到广泛的利用,而此方法尚未在嗜热真菌的转化中获得成功。本文以嗜热真菌T.lanuginosus为研究对象,首次利用农杆菌介导的方法建立了其遗传转化体系,并对该体系的转化条件进行了优化,包括农杆菌菌株,孢子萌发时间,孢子浓度及乙酰丁香酮的浓度对转化效率的影响。最终确定农杆菌菌株EHA105在孢子萌发4h,孢子浓度为5×106个/皿,共培养时AS浓度为500μM时,转化效率达到最高。随机挑选转化子进行PCR验证,结果证明潮霉素基因已经整合到受体菌的基因组中；连续转接5代,大部分转化子能够稳定遗传。对转化子进行了Southern杂交验证,单拷贝插入率较高,达到了83.3%；分离T-DNA插入位点的侧翼序列,经分析得出T-DNA的插入位点是随机的,证明该体系是一个高效获得插入突变体的体系。此外,通过电击的方法转化将质粒pUCATPH转化T.lanuginosus的原生质体,转化子经PCR验证潮霉素基因已经整合到受体菌的基因组中。蛋白激酶基因pspk是我们从疏绵状嗜热丝孢菌中分离到的1种新的蛋白激酶基因,通过生物信息学分析推测其可能具有mRNA裁剪的功能,其具体的功能尚需进行研究分析。预测蛋白质的亚细胞定位信息对于了解其功能有重要的意义,为分析T.lanuginosus蛋白激酶基因pspk的功能,构建了该基因与GFP基因的融合表达载体pROK Ⅱ-GFP-pspk,通过农杆菌介导的方式转化洋葱表皮细胞并在其中进行表达,在荧光显微镜下进行观察,绿色荧光出现在细胞核的位置,推测该蛋白激酶在洋葱表皮亚细胞定位的部位为细胞核。为进一步分析该基因的功能,依据同源重组原理构建了敲除该基因的打靶载体pUCATPH/PK和pROK Ⅱ-hygro/PK,分别用于电击转化和农杆菌介导的转化方法敲除该基因,上下游同源臂分别为739bp和737bp,为今后进行嗜热真菌T.lanuginosus中蛋白激酶基因pspk的敲除,获得pspk基因缺失的突变体,研究该基因的功能提供了重要材料。