【摘 要】
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【目的】本研究的目的是为了探究经紫外线照射的肿瘤细胞衍生的微颗粒,即紫外线诱导的肿瘤细胞微颗粒(UV-TMPs)是否能增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性;顺铂是否会诱导肿瘤细胞产生自噬;UV-TMPs是否通过抑制自噬增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。【方法】大量培养A549细胞后将其放到紫外线下照射(UVB,300J m-2),然后收集上清提取UV-TMPs。用NTA技术(纳米颗粒跟踪分析技术)
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【目的】本研究的目的是为了探究经紫外线照射的肿瘤细胞衍生的微颗粒,即紫外线诱导的肿瘤细胞微颗粒(UV-TMPs)是否能增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性;顺铂是否会诱导肿瘤细胞产生自噬;UV-TMPs是否通过抑制自噬增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。【方法】大量培养A549细胞后将其放到紫外线下照射(UVB,300J m-2),然后收集上清提取UV-TMPs。用NTA技术(纳米颗粒跟踪分析技术),电镜,WB(Western Blot)鉴定UV-TMPs的粒径分布,大小,形态以及来源。对A549细胞及UV-TMPs分别进行不同的染色,然后共聚焦显微镜下观察A549细胞对UV-TMPs的摄取情况。用StubRFP-sensGFP-LC3慢病毒感染A549细胞,然后用嘌呤霉素筛选出稳定表达StubRFP-sensGFP-LC3蛋白的A549细胞。用流式凋亡试剂盒,CCK8试剂盒和WB检测UV-TMPs单独对A549细胞的作用及UV-TMPs对顺铂毒性的增强作用。用WB及稳定表达StubRFP-sensGFP-LC3蛋白的A549细胞检测UV-TMPs是否影响A549细胞LC3蛋白的表达,从而检测UV-TMPs是否影响A549细胞的自噬过程。【结果】1.通过NTA检测及电镜观察确定用我们的方法制备出来的确实是直径分布在100-1000纳米之间的不规则球形或杯状微颗粒,即UV-TMPs。WB结果显示UV-TMPs确实是A549细胞膜来源的微颗粒。2.经含有StubRFP-sensGFP-LC3基因的慢病毒感染并用嘌呤霉素筛选纯化后的A549细胞确实能稳定表达GFP,RFP荧光。3.共聚焦显微镜下,绿色的UV-TMPs与膜被染成红色,核被染成蓝色的A549细胞共定位,说明UV-TMPs可以被A549细胞摄取。4.流式凋亡实验,CCK8,WB,迁移实验证明UV-TMPs单独不会对A549细胞的凋亡,存活起作用,但会降低A549细胞的迁移能力。5.流式凋亡实验证明了UV-TMPs可增强顺铂对A549细胞的促凋亡作用。6.CCK8试剂盒检测结果证明UV-TMPs可降低顺铂处理后A549细胞的存活力。7.WB实验结果证明UV-TMPs能促进顺铂诱导的A549细胞中Cleaved caspase-3的表达。8.荧光实验证实UV-TMPs可使自噬体或者自噬溶酶体在A549细胞内积聚。9.WB检测发现UV-TMPs及顺铂处理后A549细胞内LC3-Ⅱ增加。【结论】UV-TMPs单独作用于肿瘤细胞,不会对肿瘤细胞的凋亡,存活产生影响,但是会影响肿瘤细胞的迁移能力。UV-TMPs可以增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。顺铂能诱导肿瘤细胞产生自噬。UV-TMPs通过抑制自噬增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。
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