目前,细菌的耐药性已经是世界关注的问题。细菌感染的发生率及其病原菌的耐药率一直居高不下,对人类的健康造成了很大的威胁。整合子-耐药基因盒系统作为病原菌主要的耐药机制之一,近年来已成为研究人员关注的热点,其在革兰阴性菌中对细菌耐药性的介导作用已经得到逐步的确认。整合酶(integrease)作为整合子-耐药基因盒系统的重要元件之一在整合子中起重要作用。整合酶可以催化耐药基因盒的整合和剔除,使得耐药基因盒在不同的整合子中进行重新的组合,从而使得不同耐药基因在同种细菌和不同细菌中传播因此而逐渐增强了细菌的耐药性。本论文主要通过构建第一类整合酶基因(intI1)的重组表达载体来研究第一类整合酶基因在大肠杆菌中的表达与纯化。 第一类整合酶基因序列长度为1014bp,编码337个氨基酸,分子量为38.3kD。以确定含第一类整合酶基因的沙门氏菌S084的DNA为模板进行PCR,扩增出intI1,再将片断用Ned I和BamH I进行双酶切,将所得的目的基因插入到表达载体pET19b相应的多克隆位点,构建重组表达质粒pET19b∷intI1后,进行PCR及测序鉴定分析。用鉴定基因重组正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG小量诱导表达后收集菌体,超声破碎菌体,分离包涵体和上清,用SDS-PAGE进行分析并用western blot进行鉴定。结果表明,第一类整合酶目的融合蛋白的分子量约为38kD,与预期的分子量相符；表达量为41.8％；目的融合蛋白是以包涵体的形式表达的。为了提高重组表达质粒pET19b∷intI1在大肠杆菌中的表达量,对重组菌的培养条件及提取条件进行了较详细的研究,并对影响蛋白质表达量和工程菌生长因素如诱导温度、接种量、诱导时间等进行了探索。结果表明,在优化条件下,表达的重组目的融合蛋白占菌体总蛋白的51.1％,比优化前提高了22.2％。为了方便后续的研究我们对目的融合蛋白进行了纯化。菌体诱导培养后用FastBreakTM Reagent/DNase I溶液裂解破碎细胞,通过亲和树脂柱吸附,洗涤后再用洗脱液洗脱,最终纯化得到第一类整合酶重组目的蛋白。纯化后的目的蛋白电泳检测和western blot免疫印迹验证可得分子量为38kD,与预期的相一致。 本论文通过基因工程手段构建了第一类整合酶基因的重组表达载体,同时研究了第一类整合酶在大肠杆菌中的表达,建立了一种用以大量制备第一类整合酶的理想表达系统。同时,本论文的研究为进一步研究第一类整合酶的性质、结构和功能奠定了基础,也为控制致病菌的耐药性表达提供了研究基础。