背景和目的食管癌是一类较常见的消化道恶性肿瘤,其死亡率在全球十大肿瘤中排名第六位,我国食管癌的发病率与死亡率均较高,约占世界发病和死亡人数的一半。食管癌又分为食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma,EAC）和食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）,其中90%的食管癌病例为食管鳞状细胞癌。目前虽然在治疗食管鳞状细胞癌中取得了一些进展,但其治疗效果仍不尽人意,因此迫切需要寻找其潜在的病因以及发病机制来预防食管癌的发生。根据流行病学资料显示,长期饮用65℃以上的热水是ESCC的一个重要风险因素。例如在中国的林州市,伊朗东北部和南非等国家或地区,其居民具有饮用65℃以上热饮的传统与习惯,这可能与其食管癌的发病率存在正相关关系。尽管有诸多的研究从流行病学角度阐明了热刺激与食管癌的关系,但目前仍没有动物实验来直接表明两者关系以及其机制研究,因此本研究采用动物模型来模拟人类饮用热水的习惯,从而阐明热刺激对食管癌产生的影响及其作用机制。在本研究的动物模型中,长期饮用热水的确会对食管粘膜造成损伤,造成其粘膜癌前病变或加速4NQO诱导的小鼠食管癌形成。使用转录组学测序技术（RNA-seq）分析热水组和常温水组食管中差异表达的基因,运用RT-PCR技术筛选出体内外同时差异表达的NLRC4基因,接着又在体内外水平验证其下游蛋白caspase1与IL-1β也能够在热刺激后表达增加,进一步也验证了巨噬细胞的相关标记物也因热刺激而表达增加。最后,通过组织芯片和免疫组化染色发现与正常食管组织相比,NLRC4在食管癌组织中显著高表达,进一步敲低NLRC4的表达发现食管癌细胞的增殖能力以及克隆形成能力明显减弱。以上实验说明在热刺激诱导的食管癌模型中,NLRC4炎症小体被激活,从而引发一系列的炎症反应进而促进了食管癌的发生和发展,因此本实验的主要目的是为经常饮用热饮而引发的食管癌防治提供实验支撑以及理论依据。方法1使用致癌剂4NQO以及模拟人类饮用热水习惯,构建由热刺激诱导的小鼠食管癌模型,并使用HE染色法来分析热刺激对小鼠的食管粘膜产生的影响。2将各个实验组小鼠的食管组织进行RNA-seq测序,根据测序结果,利用RTPCR实验分析筛选出体内外差异表达的基因NLRC4。3使用Western blot以及RT-PCR进一步验证NLRC4及其下游caspase1以及IL-1β在体内外热刺激后的表达情况,并用ELISA实验分析小鼠血清中IL-1β的含量差异。4使用免疫组织化学染色法以及RT-PCR实验分析与NLRC4相关的巨噬细胞F4/80以及CD206以及巨噬细胞相关指标IFNg,NOS2以及IL-4,IL-13和CD206在热激后的变化情况。5在食管癌细胞中敲低NLRC4,首先用RT-PCR和Western blot实验来验证NLRC4的敲低效果,再通过细胞增殖试验,平板克隆实验探究其在食管癌细胞中发挥的生物学功能。6利用生物信息学查阅数据库中NLRC4在食管癌病人中的表达差异以及通过组织芯片染色分析NLRC4的表达与食管癌病人之间的相关关系。结果1长期饮用65℃以上的热水促进小鼠食管癌的发生,可能是食管癌发生的一个重要的诱因。2 RNA-seq分析结果显示热刺激与炎症反应相关,进一步通过体内外验证发现NLRC4是热刺激诱导的差异表达最大的基因。3通过RT-PCR,Western blot以及ELISA实验发现NLRC4下游caspase1与IL-1β也在体内外热刺激后被激活且表达增加。4免疫组化以及RT-PCR实验表明食管经过热刺激之后,肿瘤相关的M2型巨噬细胞的标志物CD206,IL-4以及IL-13也随热刺激而表达增加,而M1型巨噬细胞标记物IFNg表达降低而NOS2在热刺激后未见明显改变。5在敲低NLRC4之后,增殖实验与克隆形成实验表明在NLRC4被敲低后,食管癌细胞的增殖与克隆形成能力减弱。6组织芯片以及查阅数据库结果表明NLRC4在食管癌病人中表达增加并与其生存率密切相关。结论1长期饮用热水加速食管癌癌前病变与肿瘤的形成。2热刺激诱导的食管癌与炎症反应密切相关,其导致炎症小体被激活继而引发一系列的炎症反应。3 NLRC4在食管癌中表达增加并能够促进食管癌细胞的增殖与克隆形成,其可能能够成为治疗热刺激诱导的食管癌的潜在靶分子。