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木酮糖激酶催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖,处于木糖代谢物进入磷酸戊糖途径的节点位置,木酮糖的磷酸化是利用木糖发酵生产乙醇酿酒酵母工程菌的木糖代谢限速步骤之一。酿酒酵母自身具有木酮糖激酶,但由于活性较低,限制了木糖代谢工程菌的木糖代谢流向磷酸戊糖途径,进而影响乙醇的产生。超表达酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因XKS1可以加速木糖代谢流,提高酿酒酵母的木糖利用率和乙醇得率。本论文分别以KanR-up、KanR-down,ADH1T-up、ADH1T-down为引物,质粒pKT0150为模板,XKS1-up、XKS1-down,rDNA-up、rDNA-down为引物,酿酒酵母工业菌株W5基因组为模板,PCR克隆得到重组质粒载体构建所需的4个元件片段:显性选择标记G418抗性基因KanR(1477bp);用于构建基因表达的ADH1强启动子-终止子序列的ADH1终止子(301bp)片段;目标基因酿酒酵母W5自身的木酮糖激酶基因XKS1(1831bp);以及用于载体高拷贝同源重组的酿酒酵母染色体特定2.2kb rDNA。以质粒载体p406ADH1为构建骨架,利用NdeⅠ、AatⅡ、SpeⅠ、SalⅠ和Eco52Ⅰ(EagⅠ)5种限制性核酸内切酶,通过酶切连接的方式,将4个元件构建到p406ADH1中,得到片段长度为9.5kb的适合酿酒酵母工业菌株的高拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。重组质粒载体pCXS-RKTr对酿酒酵母工业菌株W5进行线性转化后,通过提高G418的浓度至1000ug/mL,筛选得到5个高拷贝的重组菌株XKS1-1、XKS1-2、XKS1-3、XKS1-4、XKS1-5,其酶活分别为141.20 U/mg、134.70 U/mg、346.76 U/mg、341.00 U/mg、374.40 U/mg。这5个重组菌的木酮糖激酶酶活较W(5130.60 U/mg)均有所提高,XKS1-1、XKS1-2略高于W5,而XKS1-3、XKS1-4和XKS1-5分别是W5的2.66倍、2.61倍和2.87倍,并且得到的重组菌有较高的遗传稳定性,这表明所构建的质粒载体pCXS-RKTr转化酿酒酵母细胞W5后成功地实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达。高拷贝同源重组载体pCXS-RKTr的构建,使木酮糖激酶基因XKS1高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上,实现了XKS1的高效稳定表达,提高了重组菌株的木酮糖激酶酶活,pCXS-RKTr是适用于对酿酒酵母工业菌株进行基因工程改造的理想载体。本研究为疏通利用木糖产乙醇酿酒酵母工程菌的木糖代谢流,提高木糖利用率,降低主要副产物木糖醇的产生量,改善木糖代谢下游途径不畅的问题,以及为利用木糖产乙醇高产酵母菌株的构建奠定了基础。