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目的:β地中海贫血(β-Thalassemia,BT)是一种常见的单基因遗传性疾病,随着发病率的增加,其已成为“全球疾病负担”。由于β珠蛋白基因突变引起β珠蛋白肽链合成减少或缺如,造成α珠蛋白肽链相对过剩,进而沉淀在红细胞膜上,导致红细胞前体细胞凋亡和无效红细胞生成(Ineffective erythropoiesis,IE),引起严重的溶血性贫血、脾脏肿大,儿童患者发育迟缓、生长阻滞。贫血严重的患者需要长期输注红细胞,生活质量差,经济负担重。目前治疗BT的方法如输血、祛铁、脾切除、诱导γ珠蛋白生成、造血干细胞移植和基因治疗等,这些治疗方法均存在一定的局限性。长期输血导致患者体内铁负荷增加,过多的铁沉积在心、肝等器官,引起脏器功能衰竭;祛铁药物不仅价格昂贵,还会引起如粒细胞减少、皮肤感染和过敏、视力和听力障碍等不良反应;脾切除会增加静脉血栓的风险等;而诱导γ珠蛋白生成的药物如羟基脲等的使用亦不能降低患者的输血需求;造血干细胞移植存在着费用高、配型困难及移植物排斥反应、移植物抗宿主病和其他治疗相关毒性反应等问题。基因治疗被认为是BT患者的替代疗法,但这种方法涉及的技术需要复杂、昂贵的资源,而且载体整合在基因组中有造成遗传毒性的可能。因此,探索新的、安全有效的治疗方法,对BT患者、家庭乃至整个社会均具有重要的科学意义。小分子RNA(microRNA,miRNA/miR)是一类长度仅为18～25个核苷酸的非编码小分子RNA,在整个生物进化过程中调控着基因表达,对于维持红系稳态亦是必不可少的。miR-144和miR-451在成熟红细胞(Redbloodcells,RBCs)中大量表达,是红细胞的保护者。当这种大量表达的miR-144/451缺失后,小鼠表现出小细胞溶血性贫血,这与红细胞对氧化应激的敏感性增加、清除活性氧的能力下降有关。急性贫血时,如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)诱导清除红系前体细胞、苯肼(Phenylhydrazine,PHZ)诱导的红细胞破坏及急性失血,从miR-144/451敲除鼠的胚胎肝(Fetal liver,FL)、骨髓(Bone marrow,BM)和脾脏(Spleen,SP)分离出的红细胞在恢复过程中表现出更多的细胞死亡。因此,miRNAs有可能成为许多重大疾病尤其是红细胞疾病诊断和治疗的工具。方法:我们以小鼠为模型,对miRNAs调控红细胞发育进行了广泛的研究,积累了大量资料。在正常和应激造血过程中,miR-144/451起到抗氧化、抗凋亡及促分化的作用。课题组前期研究工作发现miR-144/451在BT模型鼠(β-thalassemic mouse,Hbbth3杂合子,th3+/-)中显著升高,当th3+/-鼠体内miR-144/451表达缺失后,贫血得到改善。进而研究发现miR-144/451 缺失的th3+/-鼠(miR-144/451-/-th3+/-,mKO/th3+/-)中抗氧化基因核因子NF-E2相关因子(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)及其调控的抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)表达增高。本课题在前期研究的基础上,将进一步确立这个现象并寻找分子机制。(1)实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测贫血性疾病如BT、缺铁性贫血(Iron deficiency anemia,IDA)、肿瘤相关性贫血(Cancer related anemia,CRA)、再生障碍性贫血(Aplastic anemia,AA)、骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)及慢性失血性贫血(Chronic hemorrhagic anemia,CHA)中miR-144/451的表达情况;(2)qRT-PCR检测mKO/th3+/-鼠脾脏中miR-144/451的表达情况;组织病理学和免疫组织化学法观察mKO/th3+/-鼠脾脏结构和脾内红细胞变化;流式细胞术检测CD44和Ter119标记的小鼠骨髓和脾脏内红细胞,了解代偿性造血情况;(3)流式细胞术检测生物素化的红细胞寿命,了解miR-144/451缺失对BT红细胞存活的影响;(4)流式细胞术检测过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)处理前后红细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体超氧化物歧化酶指示剂(Mitochondrial superoxide indicator,MitSOX)标记的线粒体内ROS水平;分光光度计检测血清铁(Serum iron,SI);酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测铁蛋白(Serum ferritin,SF);普鲁士蓝染色法检测骨髓、脾脏和肝脏组织铁;细胞膜渗透性染料(Phen-Green-SK,PGSK)检测胞内铁;(5)利用不同方法构建的地贫鼠模型(βIVS-2-654突变)再次确认miR-144/451缺失后地贫鼠红系的表型改变;(6)利用Nrf2敲除鼠、SOD转基因鼠作为体内模型,采用功能丧失和功能获得的方法研究miR-144/451在BT抗氧化通路中的作用;(7)Nrf2不仅是抗氧化的主要调节因子,也是铁死亡的负性调控因子,我们通过一系列铁相关实验(包括生化指标和胞内铁)和铁死亡相关实验(包括透射电镜观察线粒体形态)探讨miR-144/451在BT铁死亡通路中的作用;结果:(1)miR-144/451在慢性代偿性贫血性疾病中表达明显增高,尤其在BT中增高最为显著;(2)mKO/th3+/-鼠外周血红细胞数量增多、红细胞形态好转、网织红细胞(Reticulocyte,Ret)数量减少、红细胞寿命延长、脾脏代偿造血改善;(3)miR-144/451缺失能显著降低th3+/-鼠红细胞ROS水平并改善铁过载现象;(4)从骨髓有核红细胞转录组数据中筛选出th3+/-和mKO/th3+/-鼠差异性表达的抗氧化基因Nrf2。利用qRT-PCR及免疫印迹(Western、blot,WB)的方法证实mKO/th3+/-鼠中Nrf2高表达。(5)体内过表达SOD的th3+/-鼠红系表型改善不明显。结论:(1)th3+/-鼠中miR-144/451水平显著升高;(2)miR-144/451缺失后th3+/-鼠贫血改善;(3)miR-144/451缺失后th3+/-鼠贫血改善不依赖SOD抗氧化途径。