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CPD和6-4PPs是紫外辐射造成的DNA损伤产物。光修复酶就是利用光能修复紫外损伤产物CPD和6-4PPs的一类黄素蛋白。根据结合的底物不同,分为CPD光修复酶和6-4光修复酶。我们的实验材料南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L是从南极中山站附近采集分离而来。南极衣藻长期适应极其恶劣的南极环境,尤其能抵抗南极强紫外辐射,我们推测南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶能修复紫外辐射造成的藻细胞DNA损伤,保证了藻细胞DNA的完整性,光修复酶是南极衣藻适应南极强紫外辐射环境的重要物质。本文对南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族进行了初步探究。在我们实验室之前的实验中,已经成功的从南极衣藻C.sp.ICE-L中得到了一个CPD光修复酶并验证了其具有修复CPD的活性。在此基础上,本论文对南极衣藻C.sp.ICE-L转录组进行了检索,得到了南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族基因,完成了南极衣藻光修复酶家族各基因的克隆表达及生物信息学分析,重点对6-4光修复酶的活性进行了功能研究。并首次实现了南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶双质粒共表达体系的构建,探讨了南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶相互作用机制。目的:建立南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶家族基因的表达体系,进行重组蛋白的诱导表达和纯化,得到南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶的纯化蛋白,完成重组菌的诱导培养优化,进行纯化的南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶的酶活测定,将南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶表达载体转入光修复酶缺陷的大肠杆菌以检测光修复酶的菌体内活性,对6-4光修复酶进行定点突变实验,以探究C.sp.ICE-L 6-4光修复酶相关氨基酸的功能;将两种光修复酶表达载体转入同一菌株,探讨南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶体内外的相互作用机制。方法:1.利用酶联免疫吸附技术,检测紫外辐射下(UVB,波长312 nm)南极衣藻C.sp.ICE-L CPD形成和积累。2.根据已知基因片段,采用RACE-PCR方法扩增南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶基因全长。TA克隆光修复酶的cDNA全长。3.开展实时荧光定量PCR实验。将藻细胞暴露于不同光照条件:UVB(312nm),蓝光(450 nm),红光(630 nm),黑暗。收集样品后对南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶基因的转录水平进行了检测。4.建立南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶表达体系,优化重组表达菌株的生物量和诱导蛋白浓度条件。生物量采用干重称重法,蛋白浓度采用牛血清标准曲线法测定。5.利用紫外吸收光谱技术,对得到的纯化蛋白进行酶活检测。将南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶转入光修复酶缺陷大肠杆菌,通过紫外辐射计数菌落数来计算存活率,检测南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶的体内活性。6.对南极衣藻C.sp.ICE-L的6-4光修复酶进行定点突变,以探究相关氨基酸的功能。将E193(谷氨酸Glu)突变为天冬氨酸(Asp,D),标记为E193D;用半胱氨酸(Cys,C)替代W295(色氨酸Trp),标记为W295C;H367(组氨酸His)突变为谷氨酰胺(Gln,Q),标记为H367Q。构建突变表达载体,对相关菌株进行诱导表达和纯化,得到纯化的突变后的南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶,并检测其活性,得到突变后6-4光修复酶的酶活变化。7.构建南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶双质粒共表达体系,探究CPD光修复酶和6-4光修复酶的相互作用机制。分别构建带有不同抗生素筛选标记的南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶表达载体,将其同时转入同一株菌种,使用两种抗生素进行筛选。结果:1.南极衣藻C.sp.ICE-L能适应UV-B,但生长速度低于UV0组(无紫外线辐射)。南极衣藻C.sp.ICE-L藻细胞的生长在较强的UV-B暴露中受到了抑制。在无紫外线辐射条件下,南极衣藻C.sp.ICE-L细胞中的CPD没有积累;在UV-B辐射下,在较短时间内南极衣藻C.sp.ICE-L细胞中的CPD不断积累,说明紫外线辐射对南极衣藻C.sp.ICE-L的DNA造成了损伤。2.通过基因克隆,从南极衣藻C.sp.ICE-L中获得了光修复酶基因序列的cDNA全长,分别标记为6-4CiPhr,CiPhr1,CiPhr2,CiPhr3,完成了各光修复酶基因的生物信息学分析。3.实时荧光定量PCR结果显示:光修复酶基因6-4CiPhr能够被紫外光和蓝光诱导,并在一定时间大量积累;CiPhr2和CiPhr3在蓝光胁迫条件下表达量也升高,推测这3个蛋白可能是蓝光受体。而CiPhr1在红光下被激活。4.构建了4条光修复酶序列的表达载体,经过蛋白的诱导表达和纯化,成功的得到了南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶蛋白6-4CiPhr和CiPhr1。对重组菌株的干重和蛋白浓度进行了优化培养,得到了获得其最佳干重和蛋白浓度的培养条件。5.体内体外活性检测验证了光修复酶6-4CiPhr和CiPhr1的光修复活性,实验表明南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶6-4CiPhr具有修复6-4PPs的活性。南极衣藻C.sp.ICE-L的CiPhr1可以修复CPD。6.对南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶6-4CiPhr进行了定点突变。构建了3个突变位点的重组菌株,分别对其进行了蛋白诱导表达和纯化,将纯化的突变光修复酶分别命名为:TB-E193D,TB-W295C和TB-H367Q。对纯化的突变6-4光修复酶蛋白(TB-E193D,TB-W295C和TB-H367Q)进行了酶活检测。突变光修复酶酶活检测结果显示:突变光修复酶TB-E193D修复6-4PPs的活性降低,突变光修复酶TB-W295C活性变化很小,TB-H367Q基本失去修复6-4PPs的活性。7.菌体内活性实验表明:南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶和CPD光修复酶双质粒共表达菌株的存活率都高于单独转入一种光修复酶的菌株。体外实验结果可知,纯化的混合蛋白既具有修复CPD的活性,同时又具有修复6-4PPs的活性,并且比起单一的光修复酶,其更有利于DNA损伤的修复。结论:南极衣藻C.sp.ICE-L在紫外辐射下会产生DNA损伤,形成了CPD。在持续的紫外辐射下,南极衣藻C.sp.ICE-L细胞中的CPD不断积累。CPD的积累对C.sp.ICE-L的DNA造成了损伤,并有可能造成了南极衣藻C.sp.ICE-L的生长缓慢。对南极衣藻C.sp.ICE-L转录组分析发现了四条预测为光修复酶的序列,分别标记为6-4CiPhr,CiPhr1,CiPhr2,CiPhr3。构建了南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶表达载体,分别对相关表达菌株进行蛋白诱导表达和分离纯化,得到了纯化蛋白6-4CiPhr和CiPhr1。功能验证结果显示6-4CiPhr具有修复6-4PPs的活性,并且可能是蓝光受体;CiPhr1具有修复CPD的功能。对6-4CiPhr进行定点突变,发现H367是一个关键氨基酸位点,对其进行突变,突变后的6-4CiPhr基本失去修复6-4PPs的活性。构建了南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶和CPD光修复酶双质粒共表达体系。实验表明南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶和CPD光修复酶双质粒共表达菌株的诱导蛋白更有利于修复UVB造成的DNA损伤,双质粒共表达菌株的存活率更高。