结核(TB)目前仍然是危害人类生命健康的重大传染病之一。据报道，全世界每年大约有800万新增结核病人，同时大约有200万人死于结核。此外，由于多重耐药结核菌株的出现、HIV感染及卡介苗预防效果的不佳导致结核发病率逐年增加。虽然世界上有三分之一人口感染结核，但是TB的发病率只占感染者的5-10％，大约90％的人都处于隐性感染状态，这说明机体能够有效控制结核杆菌的生长繁殖。以往的研究表明，细胞免疫包括CD4、CD8和γδ T细胞等在结核防御保护效应中发挥着十分重要的作用。动物实验表明，去除CD4+T细胞的小鼠易于感染结核，而被动转输感染过TB小鼠的CD4+T细胞后又能重获保护性免疫力。在人体有类似的证明，HIV感染的结核病人，随着CD4+T数量的下降，其病情的严重性加重，同时，肺外结核、分枝杆菌菌血症的发生率进行性增多，这充分证实了CD4+T细胞在结核免疫中的重要性。 卡介苗(BCG)是目前临床上唯一应用于预防结核的疫苗。流行病学调查的结果表明，BCG除了对儿童播散型结核的发生有一定的预防作用外，对成人结核和儿童肺结核无明显的预防作用。因此，BCG免疫或结核菌感染后是否能诱导机体产生结核特异性效应和长期记忆性T细胞，这群细胞是否能发挥有效保护作用，仍是十分重要的科学问题。目前研究的结果表明，当初始CD4+T细胞活化后，可以分化为Th1、Th2和Th17细胞等不同功能亚群，这些亚群在抵御TB感染中的作用亦不同。分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α等细胞因子的Th1细胞主要介导胞内感染病原菌的免疫应答，而且，产生不同细胞因子谱的细胞亚群所发挥效应功能及免疫记忆特性亦存在着差异。 当结核杆菌(MTB)进入机体后，机体将调动天然免疫(巨噬细胞、γδT细胞等)和获得性免疫(Th1、CD8+T细胞等)多种机制杀伤清除MTB，抑制MTB扩散；与此同时，MTB也通过释放某些抑制性蛋白或诱导机体细胞分泌抑制性因子或诱导抑制性细胞(调节性T细胞，Treg)的生成，间接或直接地抑制机体的免疫应答，甚至使免疫细胞功能失活，达到逃避免疫攻击，致使MTB在机体内存活和繁殖的目的。为此，一方面，人们期望寻找机体TB特异性免疫应答，尤其是控制MTB相关的细胞亚群；另一方面，期望阻断MTB逃逸免疫的过程以逆转MTB诱导宿主的免疫抑制状态，从而诱导抗TB免疫应答反应，防治TB。 本研究的目的在于： 1)探讨BCG免疫或结核菌感染后是否能诱导机体产生BCG特异性效应/记忆T细胞； 2)结核特异性效应/记忆T细胞的亚群(CD4、CD8、γδT细胞)、表型特征及功能； 3)结核抗原特异性效应/记忆细胞的调控因素及其机制； 4)结核病人病灶局部抗原特异性T细胞的表型和功能特点。 为了实现上述目标，该论文进行了较为系统的研究，结果分为以下四个部分： 第一部分：PPD+者或结核隐性感染者PBMCs中存在BCG特异性记忆性Th1细胞，这些细胞受到调节性T细胞的调控。 本实验以PPD+者或隐性感染者以及活动性结核病人为研究对象，检测其BCG特异性T细胞免疫应答特征，探讨了Treg细胞对其免疫应答的抑制作用及其机制。结果表明，PPD+正常人PBMCs经BCG刺激后可诱导IFN—γ的产生，且主要是CD4+而非CD8+T细胞。IFN—γ+CD4+T细胞主要为记忆细胞，包括中央型和效应型记忆细胞。为了进一步探讨Treg细胞是否调控BCG特异性效应/记忆Th1细胞的免疫应答，本研究又检测了结核病人外周血Treg细胞的数量、表型、功能特征及其调节机制。结果表明，CD4+CD25highFoxp3+和CD4+CD25highCTLA—4+细胞比例在结核病人显著地高于正常人，该细胞的表型特征为CD45RA—CD45RO+CD62Lhigh，表达HLA—DR和GITR水平高于CD4+CD25-和CD4+CD25low细胞，而且能够抑制BCG特异性效应细胞分泌IFN—γ，而加入抗IL-10中和抗体后能逆转这种抑制作用，提示免疫调节因素在结核的发病中发挥重要作用。 第二部分：BCG特异性多功能效应/记忆性T细胞的表型、功能特征及其调节。 在第一部分试验中，我们证明了PPD+者外周血中存在着BCG特异性记忆Th1细胞，这些细胞受控于Treg细胞。本实验进一步检测了BCG是否能诱导其它Th1细胞因子的产生。结果表明，除了IFN—γ之外，CD4+T细胞还分泌IL—2和TNF—α。依据分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α三种细胞因子的不同组合，BCG特异性Th1细胞至少可以分为七个亚群，其中单阳性细胞所占比例最高，且细胞因子的荧光强度在不同亚群也存在差异。以往多数研究在检测结核特异性T细胞功能时，均以细胞因子分泌作为评价指标，这并不能完全反映T细胞的功能。在本实验中，我们也发现，无论PPD+正常人或结核病人，BCG只能诱导CD4+而非CD8+T细胞产生细胞因子。然而，在相同培养条件下，CD4+和CD8+T细胞均会发生活化、分裂、增殖。表型分析表明，增殖的CD4+T细胞为CD25+CD45RA—CCR7-CD62L+，而CD8+T细胞为 CD25+CD45RA+/—CCR7+CD62Lhigh，表明这些CD4+T或CD8+T细胞为效应型或中央型记忆细胞。在多克隆刺激剂刺激后，这些BCG特异性增殖的CD4+和CD8+T细胞能够分泌Th1细胞因子，并且，特异性增殖的CD8+T细胞表达颗粒酶B。此外，我们发现Treg细胞能够抑制BCG特异性诱导的CD4+和CD8+T细胞增殖及IFN—γ分泌，这种抑制作用可部分被IL-10中和抗体所逆转。因此，本实验通过对于活化、分裂、增殖等生物学功能的检测，证明了PPD+正常人及结核病人PBMCs中存在功能性效应型/中央型记忆性CD4+和CD8+T细胞，并受到Treg的调控。 第三部分：结核菌抗原(ESAT—6)特异性记忆性γδ T细胞的表型、功能分析及其调节。 除了观察对BCG的反应性之外，本实验检测了PPD阳性正常人对于结核抗原ESAT—6的反应性，ESAT—6能显著增加IFN—γ产生的量和IFN—γ阳性细胞频数。且IFN—γ主要是由γδ T细胞而非CD4、CD8和NK细胞所分泌。此外，抗原特异性γδT细胞还分泌TNF—α，但不表达IL—2。该细胞表达CD45RO而不表达CD45RA，且脐带血单个核细胞对ESAT—6无应答，表明该抗原特异性γδ T细胞为记忆性T细胞。纯化的γδ T细胞能够对EAST—6发生应答，即不依赖于抗原提呈的作用。为进一步验证γδ T细胞应答是否需要CD4+T细胞的辅助，纯化出CD4+T细胞，发现CD4+T细胞不仅未能增加γδT细胞的IFN—γ产生，反而抑制了IFN—γ的产生，据此推论可能为Treg细胞的作用。因此，分别分离CD4+CD25+、CD4+CD25-和γδ T细胞，结果表明，Treg细胞而非CD4+CD25-细胞能够抑制γδ T细胞IFN—γ的产生，且能够被抗IL-10的中和抗体逆转，说明CD4+CD25+细胞部分通过可溶性细胞因子发挥对γδ T细胞的抑制作用。 第四部分：结核菌病灶部位(结核性胸膜炎病人胸水中)BCG特异性记忆性T细胞的表型和功能特征。 由于结核发病部位的局限性，病灶局部免疫应答对于研究结核病的免疫状态具有十分重要的意义，因此，本部分内容对于结核性胸膜炎病人胸水BCG特异性T细胞进行了分析。结果表明，BCG刺激后能够诱导CD4+T细胞分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α，且比例显著高于结核病人PBMCs。依据上述三种细胞因子的分泌与否可以将Th1细胞分为七个不同亚群，单阳性细胞亚群所占比例最高，其次为双阳性细胞亚群，最后为三阳性细胞。进一步分析各细胞亚群细胞因子表达的荧光强度，结果表明，按细胞因子产生数量的多少，(3+)>(2+)>(1+)的细胞亚群，各亚群中同种细胞因子表达的荧光强度呈下降趋势，即在单个细胞水平上进行比较时，(3+)细胞亚群不仅产生细胞因子的种类多，且产生细胞因子的量也远远高于细胞因子单阳性和双阳性细胞亚群。表型分析表明BCG特异性IFN—γ+细胞为效应型或中央型记忆细胞。 本研究的结论和创新之处： 1、PPD+正常人及结核病人PBMCs中存在BCG特异性多功能记忆CD4+T细胞； 2、BCG特异性记忆CD8+T细胞可以发生活化、分裂、增殖； 3、Treg细胞抑制BCG特异性记忆性CD4+和CD8+T细胞增殖及细胞因子分泌； 4、PPD+正常人PBMCs中存在结核菌特异性记忆性γδ T细胞，且受到Treg细胞的调控； 5、结核性胸膜炎病人胸水存在BCG特异性多功能性记忆性CD4+T细胞，但单阳性细胞亚群所占比例最高。 该研究将为深入了解疫苗免疫或结核菌感染后结核抗原特异性T细胞的表型和功能特征、结核应答的调控因素、结核杆菌逃逸机体免疫监视的机制提供理论依据，为肺结核的早期诊断和治疗、有效疫苗的设计和评价提供指导。