论文部分内容阅读
研究背景:大肠癌是常见的恶性肿瘤之一,全世界范围内大肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第3位。西方发达国家,大肠癌发病率处于第2位,仅次于肺癌。我国随着生活水平提高,饮食习惯发生高脂肪,高蛋白,低纤维,低粗粮等结构性改变,使得中国大肠癌出现高发态势,总体发病率也呈上升趋势。越是经济发达地区,大肠癌的患病率就越高。因此,大肠癌已经成为迫切需要社会关注和亟待解决的焦点问题。大肠癌的发生、发展是一个多基因参与的累积过程,目前已发现多个与其发生、发展密切相关的基因,这些基因的改变,影响着大肠黏膜上皮细胞的生物学行为。国内外研究表明,转录因子激活蛋白2α(Transcription factor activator protein-2α, AP-2α)在大多数肿瘤中被认为是一种抑癌基因。AP-2α作为一种特殊序列DNA结合蛋白,通过调控靶基因表达产物进而参与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移等。已有研究表明,癌相关基因包括p21WAF/CIP、transforming growth factor-α、c-Kit、HER-2/neu、MCAM/MUC18、c-myc、VEGF、MMP-2、KAI1、KiSS-1、ER-β等都具有AP-2α结合位点与顺式调控序列。ER-β是AP-2α的一个靶向调节基因,但在大肠癌中,AP-2α与ER-β的相互作用及对大肠癌的恶性增殖和侵袭能力的研究国内外尚未开展。这正是本实验亟待深入和解决的问题。本实验的最终目标是阐明核转录因子AP-2α在大肠癌中的可能作用和意义,以及对ER-β表达的调控机制,为揭示大肠癌发生发展的分子机制提供新的线索,为大肠癌基因诊断技术的发展和相关治疗提供新思路。研究目的:①明确核转录因子AP-2α对大肠癌SW620细胞株增殖及侵袭生长能力的影响。②明确核转录因子AP-2α调控ER-β表达的分子机制。研究方法:①在脂质体介导下将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)分别转染人大肠癌细胞株─SW620细胞,利用实时定量PCR(Real-Time PCR)、Western blot与凝胶迁移率变动实验(EMSA)鉴定AP-2α在SW620细胞中的表达及其活性;②利用MTT法和软琼脂克隆形成试验体外观察AP-2α对SW620细胞增殖能力的影响,流式细胞仪分析细胞周期及凋亡的改变情况;利用基质胶黏附实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭及迁移试验体外观察AP-2α对SW620细胞侵袭生长能力的影响。③利用实时定量PCR技术、Western blot和免疫荧光细胞化学技术分析检测转染AP-2α基因后SW620细胞中ER-β基因的表达情况;进一步根据雌激素受体(ER-β)启动子区域中可能的AP-2α结合位点设计1对寡核苷酸探针,利用EMSA技术体外水平检测各组细胞的核蛋白与这对寡核苷酸探针的结合情况。研究结果:①转染pcDNA3.1(+)-AP-2α真核表达质粒后,检测到AP-2α基因在大肠癌细胞株─SW620细胞中获得高水平表达,并且表达的AP-2α蛋白具有较强的DNA结合活性;②MTT结果提示转染AP-2α基因后SW620细胞增殖趋缓;软琼脂克隆体积小且数量少;流式细胞仪分析发现实验组静止期细胞所占比例增加,DNA合成期所占细胞比例减少,凋亡率升高;细胞的黏附、迁移与侵袭生长能力下降。③EMSA结果显示,SW620细胞中表达的AP-2α蛋白与ER-β寡核苷酸探针发生特异性结合;转染AP-2α基因后,SW620细胞中内源性ER-βmRNA含量和蛋白表达水平显著升高。研究结论:转录因子AP-2α可以抑制大肠癌细胞株─SW620细胞体外恶性增殖以及侵袭生长能力,其作用机制可能与通过直接作用于ER-β基因启动子区域(-133/-118)从而增强ER-β基因的表达有关。