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目的树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种最具潜能的抗原提呈细胞,其对抗原进行捕获、加工,处理后提呈给组织相容性复合物(majorhistocompability complex,MHC)-Ⅰ、Ⅱ类分子,诱导T淋巴细胞的增殖,在增强或调节细胞介导的免疫反应中起着决定性作用。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者DCs的相关研究目前愈来愈受到众多学者的关注。本课题拟研究慢性乙型肝炎不同感染阶段外周血来源DCs的功能特点,比较DCs中HBV不同滴度时DCs的功能差异,并研究CpG ODN能否促进DCs成熟,增强DCs功能,从而进一步揭示HBV感染不同状态下DCs的免疫功能。方法本研究对10例慢性乙型肝炎患者、10例HBV携带者及10例健康对照者外周血来源DCs进行体外培养,应用流式细胞技术检测DCs的表面分子HLA-DR、CD80、CD86的表达,ELISA检测DCs培养上清IL-12水平,以比较DCs在慢性乙型肝炎不同感染阶段的功能特点;同时运用荧光定量PCR的方法,对12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA阳性患者及10例血清HBV-DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV-DNA进行了检测,并比较DCs中HBV不同滴度时DCs的功能差异;通过予以含非甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸链(unmethylated CpG motif containingoligodeoxynucleotides,CpG ODN)干预,研究CpG ODN能否有效促进DCs成熟,增强DCs功能。结果(1)实验结果显示,体外用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养基(加GM-CSF和IL-4)诱导人的外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs)来培养DCs,24小时后可见贴壁单核细胞聚集成大小不等葡萄串状,粘附于培养板底,第3天可见这部分细胞体积增大,第4天可见部分细胞悬浮于细胞培养液,第5天可见这部分细胞数目增多,部分细胞出现许多毛刺。第7天培养液中飘浮着大量有明显树突状的大个细胞或细胞团。将培养7天的DCs收集在透射电镜下观察,每个视野充满DCs,可见细胞体积较大,细胞表面突起比较丰富,胞浆内粗面内质网丰富,线粒体结构较清楚,溶酶体丰富,核大而圆,核膜清晰,染色质分布较均匀。慢性乙型肝炎患者及HBV携带者HLA-DR、CD80和CD86的表达率较正常对照组普遍降低,但HLA-DR、CD80和CD86的表达水平在慢性乙型肝炎患者及HBV携带者之间的差异无统计学意义。ELISA检测培养第7天DCs上清IL-12水平,发现在DCs培养上清液中,IL-12的表达水平在慢性乙型肝炎患者及携带者明显低于正常人,而慢性乙型肝炎患者与携带者之间则无明显差异。(2)对12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA阳性患者及10例血清HBV-DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV-DNA进行检测发现:12例血清HBV-DNA阳性患者,其中有7例其DCs内可检测到HBV-DNA,5例DCs内未检出HBV-DNA,DCs内HBV-DNA检出率为58.3%。流式细胞仪分析显示,正常人的HLA-DR、CD80和CD86的表达阳性率均在58%以上,而慢性乙型肝炎血清HBV-DNA阳性组及血清HBV-DNA阴性组HLA-DR、CD80和CD86的表达率较正常人组普遍降低,尤以血清HBV-DNA阳性组下降更为明显。7例DCs HBV-DNA阳性组及15例DCs HBV-DNA阴性组HLA-DR、CD80和CD86的表达率亦较正常人组普遍降低,尤以DCs HBV-DNA阳性组下降更为明显。DCs培养上清IL-12水平在血清HBV-DNA阳性组明显低于血清HBV-DNA阴性组及正常人组,血清HBV-DNA阳性组又低于血清HBV-DNA阴性组。而IL-12的表达水平在DCs HBV-DNA阳性组明显低于DCs HBV-DNA阴性组及正常人组,DCs HBV-DNA阴性组又低于正常人组。相关分析显示,DCs表面分子的表达及DCs分泌IL-12水平与血清及DCs HBV载量均呈显著负相关。(3)将培养第6天的DCs,加入CpG ODN继续培养24小时后,透射电镜观察CpG ODN刺激后DCs与完全培养基对照组DCs相比,其表面的突起丰富、增粗,粗面内质网增多,空泡减少甚至消失。用流式细胞仪分析显示,CpG ODN刺激组CD80、CD86及HLA-DR的表达阳性率在慢性乙型肝炎组、HBV携带者组及正常人组均完全培养基对照组明显升高。完全培养基对照组HLA-DR、CD86、CD80的表达阳性率在慢性乙型肝炎组、携带者组及正常人组之间比较发现:慢性乙型肝炎组及携带者组HLA-DR、CD86、CD80的表达阳性率较正常人组明显下降,但慢性乙型肝炎组和携带者组之间比较却无显著性差异。CpG ODN刺激组HLA-DR、CD86、CD80的表达阳性率在慢性乙型肝炎组、携带者组及正常人组之间比较发现:慢性乙型肝炎组HLA-DR、CD86的表达阳性率较携带者组及正常人组明显下降,但携带者组和正常人组之间比较却无显著性差异;慢性乙型肝炎组及携带者组CD80的表达阳性率正常人组明显下降,但慢性乙型肝炎组和携带者组之间比较却无显著性差异。ELISA检测CpG ODN刺激组及完全培养基对照组IL-12的水平,发现CpG ODN刺激组DCs分泌IL-12的水平无论在慢性肝炎组、携带者组及正常人组均较完全培养基对照组明显升高。完全培养基对照组及CpG ODN刺激组DCs分泌IL-12水平在慢性乙型肝炎组、携带者组及正常人组之间比较发现:慢性乙型肝炎组及携带者组DCs分泌IL-12水平较正常人组明显下降,但慢性乙型肝炎组和携带者组之间比较却无显著性差异。结论(1)慢性乙型肝炎患者及无症状携带者均存在着DCs表型和功能的缺失。(2)慢性乙肝患者外周血DCs亦能受到HBV的感染,而且DCs的表型以及分泌IL-12能力与血清及DCs内HBV载量均呈显著负相关关系。(3)CpG ODN能够明显促进慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟,为CpG ODN成为治疗慢性乙型肝炎的一种新方法提供了实验基础。