论文部分内容阅读
慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的可能威胁生命的肝脏疾病。它是一个严重的全球性的公共卫生问题。它可造成慢性肝病和慢性感染且患者死于肝硬化和肝癌的风险很高。目前在中国被批准用于治疗CHB的药物有两大类:一类是免疫调节剂,包括干扰素(interferon-α,IFN)和聚乙二醇化干扰素(长效干扰素,pegylated interferon-α,PEG-IFN);另一类是核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogue,NA),包括拉米夫定(lamivudine,LAM)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)、恩替卡韦(entecavir,ETV)和替比夫定(telbivudine,Ld T)。尽管NAs比IFN有口服方便、毒副作用小及抗病毒疗效好且迅速使HBV DNA水平降低等优点。然而,长期使用NAs会导致病毒耐药几率的增加。病毒耐药和患者依从性差都是治疗失败的关键性影响因素。由于对未用过NAs治疗和使用NAs治疗的CHB患者体内HBV逆转酶区(Reverse transcriptase,RT)潜在的耐药相关突变的差异的研究甚少,因此,本论文第一章依次采用半巢式PCR、PCR产物直接测序法或克隆测序法以及生物信息学方法对169例未用NAs治疗和131例使用NAs治疗的患者的HBV RT区NAs耐药相关突变进行分析,其中HBV基因型B和C感染者分别占76.7%和23.3%。通过对NAs未治疗组和NAs治疗组进行比较,发现在B和C基因型分布及男女比例上,两组之间没有统计学差异。然而,NAs未治疗组的年龄、血清中HBV DNA的水平以及HBV E抗原阳性率显著高于NAs治疗组。通过比较HBV基因型B和C之间的突变分布发现基因型C中的RT区突变率和突变频率显著高于基因型B,差异有统计学意义。在300例CHB患者中,有155例发现了单个或多重突变。其中带有多重突变的患者的血清HBV DNA的水平显著低于没有突变或单个突变的患者。同样,在HBV B或C基因型感染者中,HBV DNA的复制水平在带有多重突变的患者中要低于没有突变的患者。并且没有突变的患者中的E抗原阳性率显著高于带有单个或多重突变的患者,且带有多重突变的患者主要见于基因型C感染者。在筛查的42个潜在的NAs耐药位点中,本研究只发现了17个,且在11个新位点发现了13种氨基酸变异。值得注意的是,在这些新发现的突变位点中,rt I187V和rt N226H在NAs治疗组中的突变率相对于其它新突变位点要高。已知的主要耐药和次要/代偿变异仅出现在NAs治疗组的7个氨基酸位点,且在这两组中均发现了预测的抗病毒药物耐药变异和治疗前突变分布在10个位点包括11种氨基酸变异。在主要耐药变异和代偿变异中,且发现有4个位点突变与LAM治疗显著相关(204、80、173、180)。而181及236位点则与ADV治疗显著相关。对于预测的抗病毒药物耐药变异和治疗前突变,有四个位点发生突变与ADV治疗显著相关,它们的突变率在ADV单疗法中显著高于其他4组,分别为191、213、214、221。而另一位点229与LAM治疗显著相关,在14个L229突变中发现有13个在以LAM为初始药物的治疗中,并且都伴随有M204V/I突变。这表明NAs治疗不仅促进一类二类主要耐药突变的选择而且还促使三类四类潜在的耐药突变发生改变。本研究还发现HBV的NAr相关位点有一定的基因型偏好性。例如,Rt L180M突变主要出现C基因型感染者中,而带有rt L80V突变的患者全部为B基因型感染者,且rt M204I和rt M204V突变分别偏好使用rt L80V和rt L180M作为补偿突变。通过对基因型B和C感染的患者进行比较发现基因型C中带有RT区突变的病毒基因组数、突变频率以及带有多重突变的几率都显著高于基因型B。相对与其它三种疗法,LAM和ADV的序贯疗法发生多重突变的几率要显著增高。在LAM联合ADV治疗组中,仅发现LAM耐药相关突变,而在LAM和ADV序贯治疗组,不仅发现LAM耐药相关突变还发现ADV耐突变rt A181T。这说明序贯疗法可能增加ADV耐药突变选择出的几率。总而言之,这些结果有助于我们了解NAs耐药相关突变的进化和选择基础以便更好的选择抗病毒治疗方法。而有关于预测的抗病毒药物耐药变异和治疗前突变对抗病毒治疗的影响还需要进一步采用体外表型分析技术进行验证。本论文第二章研究对象主要是第一章中发现的新突变。我们的目的是建立及应用体外表型分析技术对一个出现频率很高的突变rt I187V进行抗病毒药物耐药的评估。我们的目的在于评价单独rt I187V突变或是联合LAM经典耐药突变(rt M204I,rt L180M/rt M204V)时在细胞内的复制能力以及对LAM和ADV的敏感性。首先用定点突变法构建带有突变rt I187V或联合LAM经典耐药突变的复制型质粒,并且分别以野生型及LAM或是ADV经典耐药突变作为阴性及阳性对照,然后瞬时转染肝癌细胞系Hep G2进行药物敏感实验,最后检测细胞内及细胞外的HBV DNA复制情况。在这300例CHB患者中,有8.7%(26/300)的患者体内的HBV RT区的第187位氨基酸从异亮氨酸突变为缬氨酸(即rt I187V)。在NAs未治疗组及NAs治疗组中均发现了此突变,且有15例单独rt I187V突变存在于NAs未治疗组中,而有10例与LAM耐药突变联合出现与含LAM的治疗中。值得注意的是,突变rt I187V在基因型B中的突变率显著高于基因型C。体外表型分析实验显示与野生株对比,带有突变rt I187V的病毒株的复制效率显著降低。更有趣的是,突变rt I187V联合LAM耐药突变时则更进一步的降低了LAM耐药突变的复制效率。体外药物敏感实验显示突变rt I187V对LAM和ADV仍然敏感,与野生株一致,而且当rt I187V联合LAM耐药突变时对LAM仍然耐药而对ADV依然敏感。综上所述,本部分研究探讨了HBV RT区的一个高突变率的突变rt I187V,并且此突变在基因组B中的突变率很高。体外表型分析实验显示rt I187V突变的出现并不影响自身及LAM耐药突变对抗病毒药物的敏感性。然而,带有此突变的病毒株会使自身或LAM耐药突变株的复制效率显著降低。因此,我们认为突变rt I187V可能构成了HBV RT区氨基酸多态性的背景而不是影响药物敏感性的耐药突变。因此,对于带有rt I187V联合LAM耐药突变的患者,在没有新的代偿变异出现的情况下使用ADV治疗以降低选择出LAM代偿变异的几率。