论文部分内容阅读
第一部分DNA去甲基化在出生后心脏发育过程中的动态变化目的:DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶(5mC)被甲基胞嘧啶双加氧酶(TET)家族蛋白催化形成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的过程,目前认为5hmC是一种具有生物学功能的表观遗传学修饰。5hmC及TET家族蛋白在出生后心脏发育过程中的动态变化还不明确,因此我们通过检测出生后不同时间点心脏组织5hmC的水平和TET蛋白的表达了解两者在出生后心脏发育过程的动态变化。方法:分别对野生型小鼠的第1天(P1)、第14天(P14)、8周(成年)的心脏组织进行DNAdotblot和免疫荧光检测5hmC的修饰水平,用qRT-PCR和Westernblot的方法检测TET的表达。利用Tet2敲除小鼠模型检测Tet2敲除后5hmC修饰水平的变化。结果:DNA dot blot与免疫荧光结果显示5hmC修饰水平从P1到成年逐渐增加,qRT-PCR显示P1及成年心脏组织中TET2在TET家族蛋白中表达最高,其表达水平从P1到成年逐渐降低。DNA dot blot结果显示与野生型相比Tet2敲除小鼠心脏5hmC水平在P1和成年时明显下降。结论:DNA去甲基化在出生后心脏发育过程中是呈动态变化的,5hmC修饰水平在出生后随着发育逐渐增加,TET2对于心脏5hmC的形成非常重要,其水平随着发育逐渐降低。第二部分Tet2缺失促进心肌肥厚目的:心肌肥厚是心脏在长期压力负荷过重的代偿反应,表现为心肌细胞肥大和心脏纤维化,目前心肌肥厚发生的分子机制还不明确。DNA去甲基化在出生后心脏发育过程中呈动态变化,有文献报道在心肌肥厚时心肌细胞5hmC模式会发生改变,提示5hmC与心肌肥厚有关,而TET2对心脏5hmC形成的非常重要,其可能参与心肌肥厚的发生。本研究探讨TET2对心脏重塑的影响。方法:分别以成年野生型及Tet2敲除小鼠作为对照,利用异丙肾上腺素诱导心肌肥厚模型进行实验,称量小鼠体重和心脏重量,比较心体比;对各组小鼠心脏组织进行石蜡切片及HE染色、Masson染色和WGA染色;DNA dot blot检测各组小鼠心脏5hmC修饰水平;qRT-PCR检测各组小鼠心脏的Myh7、Nppa、Nppa及Col1a2的表达;超声心动图检测各组小鼠心脏功能。体外分离原代乳鼠心肌细胞,用敲低Tet2慢病毒感染结合苯肾上腺素诱导心肌细胞肥大进行细胞爬片免疫荧光,对细胞面积进行统计比较。结果:与野生型相比Tet2敲除小鼠心体比增加,Masson染色提示有心脏纤维化,WGA染色提示细胞面积增大,在异丙肾上腺素诱导心肌肥厚后心体比、纤维化及细胞面积增加更为明显;qRT-PCR结果显示与野生型小鼠相比Tet2敲除后Myh7、Nppa、Nppb及Col1a2等心肌肥厚相关基因表达增加,在异丙肾上腺素诱导后表达增加最为明显;超声心动图结果显示Tet2敲除小鼠射血分数和短轴缩短率下降,在异丙肾上腺素诱导后下降更为明显;DNA dot blot结果显示在心肌肥厚模型中5hmC的修饰水平降低;体外乳鼠心肌细胞敲低Tet2及苯肾上腺素诱导细胞肥大后细胞面积增加最为明显。结论:5hmC的修饰水平在心肌肥厚的发生中会发生变化,Tet2敲除后会促进心肌肥厚的发生并伴有心脏功能下降。第三部分Tet缺失促进心肌肥厚的机制研究目的·:探讨Tet2缺失促进心肌肥厚发生的机制。方法:选取成年野生型及Tet2敲除小鼠心脏组织进行全基因组5hmC测序获得野生型小鼠及Tet2敲除小鼠的差异羟甲基化区域(DhMRs),对DhMRs相关基因进行GO分析和KEGG分析。对成年野生型及Tet2敲除小鼠心脏组织进行转录组测序,对差异表达基因进行GO分析,结合全基因组5hmC测序及转录组测序数据库进行GO分析;Western blot检测Tet2敲除后p-ERK的蛋白水平;Western blot及qRT-PCR检测Tet2敲除后HSPA1B的表达水平;对H9C2细胞过表达TET2或HSPA1B后用Western blot检测p-ERK蛋白水平;分离乳鼠心肌细胞后敲低Tet2分别检测HSPA1B及p-ERK的水平。结果:5hmC全基因组测序结果显示野生型小鼠心脏DhMRs对应了 2957个基因,而Tet2敲除DhMRs对应了 10554个基因,其中有2556个基因重合;转录组测序结果显示Tet2敲除后有518个基因表达发生改变,其中226个基因表达上调,292个基因表达下调;在Tet2敲除DhMRs有关的基因中有337个基因表达发生改变,表达上调的基因有173个,下调的基因有164个,与心肌肥厚有关的基因上有5hmC修饰的改变;TET2的水平可以影响ERK1/2的磷酸化,当其敲除后p-ERK水平增加,过TET2表达时p-ERK水平降低;Tet2敲除后Hsp1b的5hmC水平下降,HSPA1B的表达下降,HSPA1B的水平可以影响ERK1/2的磷酸化,过Hspalb表达时p-ERK水平降低;敲低Tet2后HSPA1B的水平下降,p-ERK水平增加。结论:Tet2缺失后5hmC修饰位点的改变与心肌肥厚的发生有关,Tet2缺失后Hspalb的5hmC水平下降,从而使其表达下降激活了 ERK1/2通路,最后促进心肌肥厚的发生。