肺表面活性物质（Pulmonary surfactant，PS）是一种主要由磷脂和特异性蛋白质组成的脂蛋白复合物。PS的缺乏可引起呼吸窘迫综合症，特别在早产儿，发病率和死亡率都很高。PS的替代治疗被证实是预防及治疗呼吸窘迫综合症的有效手段，对其它肺部疾病的治疗中也具有较高的应用价值。目前我国市场上仅有两种肺表面活性物质制剂被批准上市销售，一是意大利凯西制药公司生产的固尔苏（Curosurf），剂型为混悬剂，价格昂贵，每支售价为4500元。另外一种是首都儿科研究所与双鹤药业公司合作开发的注射用牛肺表面活性剂，剂型为冻干粉，于2005年11月取得国家药检局的新药证书，每支售价为3750元。本文研究的前体脂质体型猪肺表面活性物质（proliposomes of pig pulmonary surfactant，PPPS）是一种全新的PS制剂，目前国内外尚未见相关报道。PPPS主要特点是一种空白前体脂质体，具有前体脂质体的特性，其剂型为颗粒剂型，易于长期保存和运输，也适合于工业生产，生产成本较低，来源丰富，预计每支售价在1500元左右；临床使用时加入注射用水后可以形成等张的脂质体溶液；此外，此制剂还可以作为一些药物的载体（如地塞米松针剂、病毒唑及青霉素等抗菌素）肺部给药，临床使用时加入相关药物的水溶液振荡后即可形成相关的药物脂质体的溶液，估计可能对感染引起的呼吸衰竭的治疗有一定应用价值；我国每年有新生儿约两千万，其中早产儿约占2％，大约有数十万名新生儿呼吸窘迫综合症患儿需要救治。因此，研究和制备PPPS具有很好的经济和社会效益。第一部分猪肺表面活性物质的提纯目的运用SFE-CO₂技术提纯猪肺表面活性物质，计算提纯的PPS的得率。方法1 PPS粗品的制备：猪肺支气管肺泡的灌洗，灌洗液在4℃、1000×g离心15min，上清液在4℃、13000×g离心60min，收集所得的乳白色沉淀，即为PPS粗品，共收集200只新鲜猪肺，分5批次保存，每批次40只。2 SFE—CO₂法提纯PPS：精确称取PPS粗品1g，用10ml无水乙醇、乙醚混合溶液充分溶解后（无水乙醇、乙醚按1：3体积比配制成混合溶液），加入1.5 g的硅藻土，搅拌混匀，用氮气吹干，得到干粉状混合物。将得到的干粉状混合物放入萃取槽中，采用压强范围为25-30Mpa；萃取温度为35-40℃，超临界CO₂静态浸提20分钟，再给予4小时的动态连续萃取。萃取结束后取出萃取槽中物料并称重，加入前述乙醇乙醚混合液10-20ml搅拌混匀后抽吸过滤，滤出之澄清液氮气吹干，得淡黄色粘稠状物质，即为提纯后的PPS，充氮气-20℃保存。结果本实验共提取PPS粗品180.515g，获得提纯的PPS 55.361g，提纯的PPS得率为30.521±1.700（％）。与赵倩的研究结果比较十分接近，验证了赵倩对SFE提纯PPS的萃取条件选择的正确性和可重复性。结论1运用SFE-CO₂技术提纯PS，有许多优点：萃取速度快、操作步骤少：影响萃取效率的因素如压力、温度等易于控制；本实验提纯的PPS得率为30.521±1.700（％）。验证了赵倩对SFE提纯PPS的萃取条件选择的正确性和可重复性。2影响SFE提纯PPS产量的主要因素是萃取压力、温度、动态萃取时间、静态萃取时间，其中最重要的因素是前三种。SFE提纯PPS的最佳萃取条件为：采用压力范围为25-30Mpa；选择萃取温度为35-40℃；选择动态萃取时间方面，采取经超临界CO₂静态浸提20分钟后，再给予4小时的动态连续萃取。第二部分前体脂质体型猪肺表面活性物质制备目的采用上述提纯的PPS，通过旋转蒸发仪制备PPPS，探讨制备PPPS的方法和工艺过程。方法1前体脂质体的制备：采用旋转蒸发仪进行制备。2单因素考察和正交实验：分别对钢网筛孔径、PPS的加入量、加样速率、水浴温度、进样针位置、旋转蒸发仪的转速及旋转蒸发仪的倾斜角度等进行单因素考察；然后根据预实验及单因素考察实验的结果，确定正交实验的因素和范围，进行正交实验。3所得数据用SPSS13.0统计软件进行分析，以0.05作为显著性差异的指标。结果单因素考察结果发现，PPS的加入量在1.6-1.8g时，PPPS的产品率都在90％以上，在加入量超过2.0g后，产品率明显下降；PPPS的产品率随着PPS加样速率的升高而下降，尤其是当加样速率大于1.1ml／5min时产品率明显下降；方差分析表明，PPS的加入量的三个水平间差异均有显著性意义（P=0.004），以加入量为1.8g时的产品率最高；PPS加样速率的三个水平间差异均有显著性意义（P=0.029），以加样率在0.9ml／5min时的产品率最高；而水浴温度的三个水平间差异均没有显著性意义（P=0.549）。各因素对产品率的影响程度依次为PPS的加入量＞PPS加样速率＞水浴温度。结论1在制备PPPS的过程中，氯化钠晶体颗粒量为1.8g，PPS的加入量为1.8g、加样率在0.8-0.9ml／5min、温度在42-46℃范围内比较合适。最佳制备条件为：PPS的加入量为1.8g；PPS加样速率0.9ml／5min；水浴温度为44℃。2在制备PPPS的过程中，各因素对产品率的影响程度依次为PPS的加入量＞PPS加样速率＞水浴温度。第三部分前体脂质体型猪肺表面活性物质的化学组分分析目的分析和比较PPPS和其他PS制剂的化学组分。方法1 PPPS的各组分含量测定：总磷脂含量测定采用硫酸—过氯酸消化孔雀绿显色法；蛋白质含量测定采用考马斯亮兰法、胆固醇和甘油三酯含量测定均按照试剂盒说明进行操作。2 PPPS中磷脂的各组分分析：采用高效液相色谱法。3所得数据用SPSS13.0统计软件进行分析。结果1 PPPS产物中各化学组分含量为磷脂（91.82±1.77）％，甘油三脂（0.76±0.14）％，胆固醇（0.98±0.14）％，蛋白质（1.72±0.18）％。甘油三脂、胆固醇及蛋白质含量均较低，磷脂含量较高，均在90％以上，提示本研究制备的PPPS产物中磷脂的含量符合PS制剂标准。2 PPPS的各磷脂组分的构成比为：磷脂酰胆碱（80.5±2.32％）、磷脂酰甘油（7.48±0.80％）、磷脂酰乙醇胺（3.80±0.76％）、磷脂酰肌醇（2.98±0.85％）、神经鞘磷脂（2.26±1.0％）、磷脂酰丝氨酸（1.69±0.58％），磷脂酰胆碱含量比其它PS制剂高，并且磷脂成分齐全，提示所制备的PPPS在磷脂组成成分方面已达到PS制剂标准。结论本研究制备的PPPS产物中各化学组分含量和各磷脂组分的构成符合PS制剂标准。第四部分前体脂质体型猪肺表面活性物质的物理化学性质研究目的了解PPPS的物理化学的性质。方法1用精密酸度计、光学显微镜、透射电镜、乌式粘度计等仪器测定和分析PPPS的物理化学的性质。2用SPPS13.0软件统计分析，以0.05作为显著性差异的指标。结果1 PPPS外观平呈淡黄色疏松颗粒状，休止角为34℃，流动性较差。PPPS放置于不同的温度下，颜色与粘度变化较大，当温度大于20℃时，PPPS在很短的时间内颜色变黄，粘度增加，各组（4-8℃、20℃、40℃、60℃）间，变黄时间差异有显著性意义（χ²=16.773，P=0.001）；变粘时间差异有显著性意义（χ²=17.703，P=0.001）。经重复测量数据的方差分析结果为，在各个温度（4-8℃、20℃、40℃）下，不同天数测定的过氧化值数值之间的差异均有显著性意义（F=4584.027，P＜0.001）；不同天数测定的过氧化值数值在不同温度组别之间的差异均有显著性意义（F=3091.756，P＜0.001）；在光照（20℃）下，不同天数测定的过氧化值数值之间的差异均有显著性意义（F=972.340，P＜0.001）。2 PPPS用注射用水再分散后形成脂质体微粒，脂质体微粒直径在100—900nm之间，呈球状和囊泡状；pH值为6.361±0.032；特性粘数为1.36±0.12 mPas。结论PPPS具备前体脂质体的物理化学特性，符合PS制剂标准，应低温（4-8℃）避光保存。第五部分前体脂质体型猪肺表面活性物质的体外活性测定目的了解PPPS的表面活性特征。方法1采用JM99A动态膜压记录仪测定PPPS的表面活性特征。2所得数据用SPSS13.0统计软件进行分析。结果测得代表PPPS降低表面张力和膜稳定性的指标如下：最小表面张力r_mix=4.55±0.72mN／m，最大表面张力r_max=44.88±4.33mN／m，稳定系数SI=1.85±0.36，反弹系数RI=39.05±6.67。PPPS能自动在气-液界面上快速吸附、扩展，形成单分子膜，并且在表面压缩时，能将表面张力降到10mN／m以下。结论PPPS制剂加入注射用水水化后可有效降低表面张力，具备PS的表面活性特征，SI和RI都符合PS制剂要求，达到外源性PS替代制剂标准。第六部分前体脂质体型猪肺表面活性物质对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的影响目的观察PPPS对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的影响。方法制备整肺灌洗兔呼吸窘迫模型，将PPPS用注射用水水化，经气管滴入模型兔（剂量为100mg／kg体重），观察其心率（heart rate, HR）、呼吸频率（breathing rate, BR）收缩压（systolic blood pressure, SBP）和舒张压（diastolic blood pressure, DBP）、血气、潮气量（tidal volume, TV）和动态肺顺应性（dynamic lung compliance, Cdyn）等指标以及肺的病理学变化。用SPSS13.0统计软件对各个指标数值进行重复测量数据的方差分析，以0.05作为显著性差异的指标。结果整肺灌洗后模型兔的血气pH，PaO₂急剧下降，PaCO₂轻度上升，心率明显减慢而呼吸频率增加，SBP和DBP均明显下降；支气管肺泡灌洗液中PS含量明显下降；病理检查提示出现肺出血、肺不张、肺泡萎缩、透明膜形成等病变。符合Ⅰ型重症呼吸衰竭临床诊断标准。经气管滴入PPPS后，可以使RDS模型兔的各项指标（pH、PaO₂、PaCO₂、HR、BR、SBP，DBP）明显改善，肺部的病理改变也明显减轻。统计学分析结果提示，pH（F值=4.572，P=0.046）、PaO₂（F值=557.586，P＜0.001）、PaCO₂（F值=96.798，P＜0.001）、TV（F值=117.851，P＜0.001）、Cydn（F值=276.996，P＜0.001）、HR（F值=34.975，P＜0.001）、BR（F值=28.167，P＜0.001）、SBP（F=124.751，P＜0.001）和DBP（F=108.672，P＜0.001）的数值在治疗组和对照组比较，之间差异均有显著性意义；在治疗组中，各个时间点的pH、PaO₂、PaCO₂、TV、Cydn、HR、BR、SBP和DBP的数值的比较，之间的差异均也有显著性意义（P＜0.001。）结论PPPS可明显改善肺灌洗呼吸窘迫模型兔的心肺功能，减轻肺的病理改变，表明PPPS对呼吸窘迫有一定的治疗作用。小结1本文运用SFE-CO₂方法提纯PS，获得提纯的PPS 55.361g，提纯的PPS得率为30.521±1.700（％）。验证了SFE提纯PPS的最佳萃取条件为：压力范围为25-30Mpa；萃取温度为35-40℃；选择动态萃取时间方面，采取经超临界CO₂静态浸提20分钟后，再给予4小时的动态连续萃取。2本文通过旋转蒸发仪将提纯的PPS制备成PPPS，并且对PPPS制备的方法和工艺过程进行了研究，确定了制备PPPS的最佳条件为：PPS的加入量为1.8g；PPS加样速率0.9ml／5min；水浴温度为44℃。3本文分析了PPPS制剂的化学组分和磷脂的各组分，PPPS产物中各化学组分含量分别为磷脂（91.82±1.77）％，甘油三脂（0.76±0.14）％，胆固醇（0.98±0.14）％，蛋白质（1.72±0.18）％；PPPS的各磷脂组分的构成比为：磷脂酰胆碱（80.5±2.32％）、磷脂酰甘油（7.48±0.80％）、磷脂酰乙醇胺（3.80±0.76％）、磷脂酰肌醇（2.98±0.85％）、神经鞘磷脂（2.26±1.0％）、磷脂酰丝氨酸（1.69±0.58％）。表明本研究制备的PPPS符合PS制剂对化学成分和磷脂的各组分的要求。4本文分析了PPPS的物理化学的性质，PPPS外观平呈淡黄色疏松颗粒状，休止角为34℃，流动性较差。PPPS放置于不同的温度下，颜色与粘度变化较大，当温度大于20℃时，PPPS在很短的时间内颜色变黄，粘度增加。光照对PPPS的过氧化值有较大的影响，在20℃下，随着光照时间的增加，过氧化值升高；在各个温度（4-8℃、20℃、40℃）下，随着保存时间的增加，过氧化值升高。因此，建议PPPS应低温（4-8℃）避光保存。PPPS用注射用水再分散后形成脂质体，脂质体颗粒直径在100—900nm之间，呈球状和囊泡状。pH值为6.361±0.032。特性粘数为1.36±0.12 mPas。表明PPPS具备前体脂质体的物理化学特性。5本文分析了PPPS的体外表面活性特征，其最小表面张力r_mix=4.55±0.72mN／m，最大表面张力r_max=44.88±4.33mN／m，稳定系数SI=1.85±0.36，反弹系数RI=39.05±6.67。PPPS能自动在气-液界面上快速吸附、扩展，形成单分子膜，并且在表面压缩时，能将表面张力降到10mN／m以下，表明本研究制备的PPPS具备良好的PS制剂体外表面活性。6本文成功建立了整肺灌洗兔RDS模型，观察了PPPS对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的各项指标（pH、PaO₂、PaCO₂、HR、BR、SBP，DBP）和肺病理变化的影响，结果表明PPPS对整肺灌洗兔RDS模型有一定的治疗作用。