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中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）损伤后的修复受多种因素影响,其中抑制因子释放和胶质瘢痕形成为主要原因之一。目前已经分离和鉴定的轴突生长抑制因子有:Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白（myelin-associatedglycoprotein,MAG）、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte-myelinglycoprotein,OMgp）等。研究发现,Nogo-A、MAG、OMgp发生作用时都有LINGO-1蛋白的参与。在胶质瘢痕对轴突再生的影响中,硫酸软骨素蛋白多糖（Chondroitin Sulphate Proteoglycans,GSPGs）是目前已知的一个阻碍轴突再生的重要因子,特异存在于CNS,而Neurocan则为GSPGs的核心蛋白组分之一,并且显示了对视网膜神经节细胞神经突生长的抑制作用。腱糖蛋白-R（tenascin-R,TN-R）是瘢痕组织中所含有的另一种有轴突生长抑制作用的细胞外基质成分。把LINGO-1、Neurocan和TN-R设计成三基因联合DNA疫苗,将会使疫苗在体内发挥作用后、产生抗体并与相关抑制因子结合,以消除抑制作用、促进神经再生。本研究则主要是进行Neurocan基因的蛋白表达及其抗体制备,并且对其进行检测,探讨DNA疫苗制作前期技术方案的可行性,为后续CNS损伤修复实验工作奠定基础。目的制备Neurocan蛋白,用此蛋白免疫动物制备抗血清,并对抗血清的效价和特异性进行检测,最终使待参与DNA疫苗构成的Neurocan蛋白所产生抗体能与脑内创伤区的相应抑制性蛋白抗原结合。方法从基因库调出Neurocan的基因序列,合成Neurocan基因,序列起始端加His标签,两端设计酶切位点。构建原核表达质粒PET30a（+）-Neurocan,对合成的Neurocan基因进行测序鉴定。将质粒转化到大肠杆菌BL21感受态,挑菌培养,使用OMEGA公司质粒提取试剂盒(E.Z.N.A.TMPlasmid Mini KitⅡ50)提取质粒。对质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定,鉴定正确后,对菌株进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1- Thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,采用不同的诱导时间和IPTG浓度,确定最佳表达条件。对目的蛋白进行纯化,使用PIERCE公司的BCATM Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白浓度。对目的蛋白进行SDS-PAGE检测,观察目的蛋白的纯度和分子量大小;对目的蛋白进行Western blot鉴定,一抗使用小鼠抗His抗体,二抗使用马抗小鼠—AP抗体,显色底物为NBT/BCIP。Neurocan蛋白免疫兔制备免疫血清,分4次免疫,皮内注射。Elisa法检测抗血清效价,以Neurocan蛋白包被酶标板,兔免疫前血清为阴性对照,二抗为山羊抗兔-HRP,底物显色后酶标仪检测;Western blot检测抗血清特异性,以免疫血清为一抗,山羊抗兔-AP为二抗,NBT/BCIP显色。结果合成的Neurocan基因经测序鉴定,显示序列正确,且开放读码框正确。Neurocan基因经连接、转化、诱导表达后,测得蛋白浓度为0.673ug╱ul。目的蛋白经SDS-PAGE鉴定,目的条带分子量大小约为55kD;经Western blot鉴定,在55kD处有特异性条带,与SDS-PAGE鉴定结果一致,目的蛋白能与His抗体特异性结合。制备的抗血清经Elisa法检测,效价达到1:100万;经Westernblot检测,在55kD处的目的条带明显。讨论本研究中,首先对合成的Neurocan基因进行了测序鉴定,显示其序列正确,且开放读码框和酶切位点与本课题设计的一致。接着将包含Neurocan基因的质粒PET30a（+）-Neurocan转化到大肠杆菌BL21,进行Neurocan蛋白的原核表达,对表达出的蛋白进行SDS-PAGE鉴定,其分子量大小与通过碱基数计算出来的大小一致。进一步对其进行Western blot鉴定,因为本实验在Neurocan基因的起始端设计了His标签,故一抗用His抗体,结果显示目的蛋白能与His抗体特异性结合,说明该目的蛋白是Neurocan基因的表达产物,而Neurocan基因经过测序鉴定正确,提示Neurocan蛋白的原核表达成功。用此蛋白免疫兔制备的抗血清,经Elisa检测,效价达到1:100万;进一步用Western blot检测,都证明特异性良好,所制备的多克隆抗体能与Neurocan蛋白特异性结合。因此提示,Neurocan蛋白原核表达成功;用Neurocan蛋白免疫兔,产生的抗体能与Neurocan蛋白特异性结合,为DNA疫苗的进一步研制及CNS损伤后修复策略提供了有意义的参考依据。