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研究背景和目的特发性股骨头坏死（Idiopathic necrosis of the femoral head,INFH）是造成青壮年残疾的常见原因之一,严重影响患者的生活质量,为家庭和社会带来了沉重的经济负担,但其发病机制尚不明确。因此,探索INFH发病机制,降低INFH发病率已成为关节外科医生共同努力的目标。INFH患者的股骨头病理样本可见软骨下骨的塌陷及坏死区骨质疏松,表明股骨头局部出现骨代谢的异常。骨代谢是维持骨组织稳态的重要生理过程,受体内众多因素的调节,骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是这一过程中必不可少的细胞群体。BMSC是一种多能干细胞,存在于骨髓基质中,可分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。BMSC在向骨细胞及脂肪细胞分化过程中有Wnt信号通路参与,Wnt表达变化可影响BMSC的增殖与分化。不仅如此,BMSC中骨代谢过程还受其他因子调节,富含亮氨酸的重复序列17（Leucine-rich repeat-containing 17,LRRC17）即为其中重要的调节因子。既往研究显示LRRC17在骨质疏松患者体内表达量显著降低,同时LRRC17可以负性调节核因子-κB配体的受体激活剂（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）,抑制骨的溶解,且预实验发现 LRRC17在INFH患者股骨头骨组织中的表达量显著降低,由此表明LRRC17对于骨代谢有重要的调节作用。鉴于LRRC17及Wnt通路对骨代谢的调节作用,因此,本课题首先拟通过转录组测序（RNA-Seq）研究INFH与股骨颈骨折（Femoral neck fracture,FNF）患者骨样本中差异基因表达谱的变化,并发现INFH的可能致病基因;其次研究LRRC17对特发性股骨头坏死患者来源的骨髓间充质干细胞（INFH-BMSC）及股骨颈骨折患者来源的骨髓间充质干细胞（FNF-BMSC）中成骨、成脂分化的调节作用;最后探讨LRRC17通过Wnt通路调节INFH-BMSC中骨稳态的作用及作用机制。研究方法1.研究INFH与FNF患者骨组织中差异表达基因的变化及意义:采用RNA-Seq检测INFH与FNF患者骨样本中差异表达基因,并进一步采用RT-qPCR（Real-time Quantitative PCR）及Western-Blot对兴趣差异基因进行验证。2.研究INFH与FNF患者股骨头组织中骨代谢的变化及INFH-BMSC、FNF-BMSC生物学功能的差异。对于骨代谢变化的研究,采用HE染色观察INFH患者股骨头骨组织中骨小梁的结构、破骨细胞、脂肪细胞数量的变化。对于INFH-BMSC及FNF-BMSC生物学功能变化的研究,通过Ficoll梯度离心INFH及FNF患者来源的股骨近端骨髓血样本,分离并培养各组BMSC。采用流式细胞仪对INFH-BMSC及FNF-BMSC进行表型鉴定,观察CD34、CD44、CD45、CD90的表达变化;进一步通过茜素红、油红O染色分别检测BMSC的成骨、成脂多向分化的潜能;采用CCK-8观察INFH-BMSC及FNF-BMSC活力的变化;AnnexinV-FITC法及活性氧（ROS）检测试剂盒评估INFH-BMSC 及 FNF-BMSC 的凋亡率及 ROS 含量;RT-qPCR 及 Western-Blot 检测INFH-BMSC 及 FNF-BMSC 中 LRRC17、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）、Runt 相关转录因子 2（Runt-related Transcription Factor 2,RUNX2）的 mRNA 及蛋白表达的变化。3.研究LRRC17通过Wnt通路相关因子调节INFH-BMSC中骨代谢稳态的作用及作用机制:为研究LRRC17对INFH-BMSC中骨代谢作用,将细胞分为oe-Control组、oe-LRRC17组、sh-Control组、sh-LRRC17组,采用RT-qPCR及Western Blot研究过表达或干扰 LRRC17 后 BMSC 中骨形态发生蛋白 2（Bone morphogenetic protein,BMP2）、OPG、RUNX2,过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ）、CCAAT 增强子结合蛋白 α（CCAAT/enhancer binding protein α,C/EBPα）及Wnt信号通路相关因子Wnt3a、β-Catenin、Wnt5a及Rankl的mRNA及蛋白表达量的变化。此外,为进一步研究LRRC17通过Wnt信号通路调节骨代谢的作用机制,给予Wnt经典通路抑制剂 DKK1（细胞分为 oe-LRRC17 组、oe-LRRC17+DKK1 组、oe-Control组、oe-Control+DKK1组）,研究Wnt3a、β-Catenin蛋白表达量的变化;给予Wnt非经典 JNK 通路抑制剂 Sp600125（细胞分为 sh-LRRC17 组、sh-LRRC17+Sp600125 组、sh-Control 组、sh-Control+Sp600125 组）,研究 Wnt5a、Rankl蛋白表达量的变化。最后采用细胞免疫荧光法研究LRRC17通过Wnt信号通路调节RUNX2及PPARγ蛋白表达的变化,进一步明确LRRC17调节骨代谢的机制。研究结果1.RNA-Seq结果显示,与FNF组相比,INFH组差异表达基因共155个,其中,上调的差异表达基因为96个,下调的差异表达基因为59个。在这些差异表达基因中LRRC17的下调最为显著。进一步通过RT-qPCR对兴趣基因进行验证,该结果与RNA-Seq测序结果一致。2.HE染色结果显示,与FNF患者股骨头相比,INFH患者股骨头中骨小梁结构明显破坏,破骨细胞增多,脂肪细胞增多,空泡状坏死组织明显增多。成功分离、培养了INFH-BMSC及FNF-BMSC,INFH及FNF组的BMSC外形均呈现纺锤形,流式细胞仪检测证明两组来源的BMSC的造血细胞表型CD34-FITC（-）,白细胞表型CD45-FITC（-）,而 CD44-FITC（+）,CD90-FITC（+）。此外,INFH-BMSC 及 FNF-BMSC 均具有成骨及成脂多向分化的潜能;然而,茜素红染色显示INFH-BMSC组的成骨诱导分化能力较FNF-BMSC组减弱（P＜0.05）,同时油红O染色显示INFH-BMSC组的成脂诱导分化能力较FNF-BMSC组增强（P＜0.05）;INFH-BMSC组细胞增殖能力与FNF-BMSC组比较无显著差异（P＞0.05）;INFH-BMSC组细胞凋亡比率及活性氧水平高于FNF-BMSC 组（P＜0.05）。与 FNF-BMSC 组相比,INFH-BMSC 组中 LRRC17 基因及蛋白的平均表达水平均低于FNF-BMSC组（P＜0.05）;同时INFH-BMSC组中OPG、RUNX2基因的平均表达水平均低于FNF-BMSC（P＜0.05）。3.研究显示,与 oe-Control 组相比,oe-LRRC17 组中 LRRC17、OPG、BMP2、RUNX2、Wnt3a、β-Catenin mRNA及蛋白的表达量均增高（P＜0.05）;而PPARγ、C/EBPα、Wnt5a、Rank1 mRNA 及蛋白表达量均低于 oe-Control 组（P＜0.05）。与 sh-Control 组相比,sh-LRRC7 组中 LRRC17、OPG、BMP2、RUNX2、Wnt3a、β-Catenin mRNA 及蛋白表达量均降低（P＜0.05）;而 sh-LRRC7 组中 PPARγ、C/EBPα、Wnt5a、Rank1 mRNA及蛋白表达量均高于sh-Control组（P＜0.05）。与oe-LRRC17组相比,oe-LRRC17+DKK1组中Wnt3a和β-catenin的蛋白表达量均降低（P＜0.05）;与oe-Control组相比较,oe-Control+DKK1 组中 Wnt3a 和 β-catenin 的蛋白表达量均低于 oe-Control 组（P＜0.05）;而oe-LRRC17+DKK1组与oe-Control组中Wnt3a及β-catenin的蛋白表达量无显著差异（P＞0.05）。与 sh-LRRC17 组相比较,sh-LRRC17+Sp600125 组中 Wnt5a、Rankl 的蛋白表达量均降低（P＜0.05）;与 sh-Control 组相比较,sh-Control+Sp600125 组中 Wnt5a、Rankl的蛋白表达量均低于sh-Control组（P＜0.05）;而sh-LRRC17+Sp600125组与sh-Control组中Wnt5a、Rankl的蛋白表达量无显著差异（P＞0.05）。与oe-Control组相比较,oe-Control+DKK1组中PPARγ荧光强度显著强于oe-Control组（P＜0.05）;与oe-LRRC17组相比较,oe-LRRC17+DKK1组中PPARγ荧光强度显著强于 oe-LRRC17 组（P＜0.05）;而 oe-LRRC17+DKK1 组与 oe-Control 组中 PPARy 荧光强度无显著差异（P＞0.05）。与oe-Control组相比较,oe-Control+DKK1组中RUNX2荧光强度显著弱于 oe-Control 组（P＜0.05）;与 oe-LRRC17 组相比较,oe-LRRC17+DKK1组中RUNX2荧光强度显著弱于oe-LRRC17组（P＜0.05）;而oe-LRRC17+DKK1组与oe-Control组中RUNX2荧光强度无显著差异（P＞0.05）。与sh-Control组相比较,sh-Control+Sp600125 组中 PPARγ 荧光强度显著弱于 sh-Control 组（P＜0.05）;与sh-LRRC17组相比较,sh-LRRC17+Sp600125组中PPARy荧光强度显著弱于sh-LRRC17组（P＜0.05）;而sh-LRRC17+Sp600125组与sh-Control组中PPARγ荧光强度无显著差异（P＞0.05）。与 sh-Control 组相比较,sh-Control+Sp600125 组中 RUNX2 荧光强度显著强于 sh-Control 组（P＜0.05）;与 sh-LRRC17 组相比较,sh-LRRC17+Sp600125 组中RUNX2 荧光强度显著强于 sh-LRRC17 组（P＜0.05）;而 sh-LRRC17+Sp600125 组与sh-Control组中RUNX2荧光强度无显著差异（P＞0.05）。结论1.INFH患者股骨头骨组织与FNF患者骨组织中mRNA表达谱存在差异。差异基因主要富集到PPAR信号通路、Rap信号通路、Ca2+信号通路、Wnt信号通路等。2.INFH患者在组织学表现及细胞学特性方面与FNF患者存在差异。INFH患者股骨头中出现骨代谢异常,异常的骨代谢会导致股骨头形态的异常。3.LRRC17具有促进成骨而抑制成脂分化的能力。LRRC17通过上调Wnt信号通路中的β-Catenin、Wnt3a及下调Wnt5a、Rankl使INFH患者的BMSC有利于成骨。并且Wnt/β-Catenin经典信号转导通路及Wnt非经典信号转导通路均参与了 LRRC17调节INFH患者骨代谢的过程。意义本课题为研究INFH的发病机制提供了一种新的思路,为研究骨代谢在INFH发生和发展过程中的作用机制提供了科学依据,为INFH早期防治提供关键基因靶点。