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研究背景卵巢癌是世界上最致命的妇科恶性肿瘤,因此病全球每年死亡人数超过125,000人,严重威胁着女性的生殖健康。尽管自铂类药物出现以来,总体上患者生存有所改善,但大多数接受治疗的妇女最终都会导致化疗耐受(耐药)。了解耐药的机制,如何逆转这种耐药,成为当前研究的热点。缺氧广泛存在于各种实体瘤,缺氧是导致癌细胞耐药的重要因素。因为95%的氧是在线粒体消耗的,因此线粒体是细胞缺氧时最受影响的细胞器。根据内共生学说的观点,线粒体是“噬氧菌”被真核祖细胞吞噬,在长期的共生过程中,逐渐演化而成的。因此,线粒体具有细菌的属性。缺氧可引起线粒体等细胞器功能不足或受损,引起部分细胞受损甚至死亡,细胞内的核酸、多肽等释放到细胞外,或被包封在细胞内的膜泡结构内。例如线粒体DNA(mt DNA)含有大量与细菌类似的未甲基化CpG序列,mt DNA激活Toll样受体-9(Toll like receptor 9,TLR9)等介导的信号途径,引起多种反应;另外,线粒体也含有与细菌类似的甲基化多肽,这些多肽可激活甲酰肽受体(formyl peptide receptor,FPR)介导的信号途径。TLR9、FPR与肿瘤多种恶性行为相关,但在缺氧诱导肿瘤耐药过程中的作用与机制,尚缺乏深入研究。研究目的探讨FPR和TLR9在缺氧诱导人卵巢癌细胞耐药中的作用及机制。研究方法1.将人卵巢癌细胞(SKOV3)置于1%O2的缺氧条件下不同时间(0h、6h、12h、24h),24h后检测顺铂对细胞的抑制率。2.将SKOV3置于常氧(21%O2)和缺氧(1%O2)培养箱内不同时间(6h、12h、24h后,收集上清。同时,用FPR特异性拮抗剂t-Boc、TLR9拮抗剂氯喹(CQ)或生理盐水(作为对照组)处理未缺氧的SKOV3细胞,然后用缺氧上清刺激这些未缺氧的SKOV3细胞,24h后检测顺铂对细胞的抑制率。3.通过WB的方法检测人卵巢癌组织和细胞中FPR的表达,通过WB、免疫荧光和RT-PCR的方法检测人卵巢癌组织和细胞中TLR9的表达。4.用FPR激动剂fMLF或者用tBoc将FPR拮抗后再加f MLF刺激SKOV3,通过趋化实验检测FPR的功能活性。用fMLF或tBoc+f MLF刺激细胞不同时间(6h、12h、24h),CCK8检测顺铂对细胞的抑制率。用TLR9激动剂ODN2006刺激细胞不同时间(6h、12h、24h),顺铂处理细胞24h后通过CCK8检测顺铂对细胞的抑制率。5.用收集的常氧上清、缺氧上清刺激经过t Boc或CQ处理的SKOV3后,用Western Blot检测多药耐药相关蛋白(MRP)、P糖蛋白(P-gp)、P53、Beclin1的表达。研究结果1.缺氧促进卵巢癌细胞耐药用“缺氧时SKOV3抑制率变化的百分比”表示“缺氧诱导的耐药性”(HICR值)。与未缺氧组比较,缺氧各组细胞对顺铂的抑制率不同程度降低,HICR值不同程度增加。缺氧6h组的HICR值增高无统计学意义(p>0.05)。缺氧12h和24h组,细胞对顺铂的抑制率显著降低,HICR值显著增高(p<0.01)。2.缺氧上清促进卵巢癌细胞耐药用不同时间的缺氧上清处理SKOV3,上清浓度为60%和80%时,与常氧12h和24h上清处理组相比,缺氧12h和24h上清刺激细胞后,细胞对顺铂的敏感性显著降低(p<0.05),即耐药性增加;当上清浓度为100%时,缺氧6h上清刺激细胞后,也显著降低对顺铂的敏感性,显著增加肿瘤细胞的耐药性(p<0.05)。3.卵巢癌组织和卵巢癌细胞中FPR和TLR9的表达FPR与TLR9在人卵巢癌组织和人卵巢癌细胞(SKOV3)中均有表达,卵巢癌组织中其表达与与MRP的表达呈显著正相关(p<0.05)。FPR激动剂fMLF刺激,可引起剂量依赖性的SKOV3趋化反应(p<0.05)。缺氧上调两受体的表达,其蛋白水平增加程度随缺氧时间增加而增加,缺氧12h和24h其增加具有显著性统计学意义(p<0.05),TLR9的mRNA水平也呈相似的变化。另外,免疫荧光结果显示TLR9在细胞膜和细胞质中均有表达。4.激活FPR或TLR9促进SKOV3细胞耐药FPR特异性激动剂f MLF或者TLR9特异性激动剂ODN2006处理SKOV3不同时间后,显著降低顺铂对细胞的抑制率(p<0.05),即细胞的耐药性增加。5.拮抗FPR或TLR9抑制缺氧上清对耐药性的诱导FPR特异性拮抗剂t-Boc显著降低HICR值,即抑制了缺氧上清对耐药性的诱导作用。t Boc不同程度地降低了HICR值。对6、12h缺氧上清,10nM的t Boc即可显著降低其HICR值,102、103n M t Boc更加明显降低HICR(p<0.05);对24h缺氧上清,100nM的t Boc才能显著降其HICR值(p<0.05),103nM t Boc更加明显降低其HICR(p<0.05)。TLR9拮抗剂(CQ)预处理后,不同程度地降低HICR值。10μM CQ即可以显著降低缺氧各组的HICR值(p<0.05);100μM CQ对缺氧6h上清的HICR没有显著影响,但可以显著降低缺氧12h和24h上清的HICR值(p<0.05)。1000μM CQ对各组HICR均没有显著影响(p>0.05)。6.FPR或TLR9在缺氧上清上调耐药相关蛋白变化的作用缺氧上清显著上调MRP、P-gp、P53、Beclin1表达(p<0.05),FPR特异性拮抗剂t Boc显著削弱缺氧上清对这些蛋白表达的上调作用(p<0.05),Beclin1的表达变化差异无统计学意义(p>0.05)。除了对Beclin1外,TLR9的拮抗剂CQ也可产生类似的效应。研究结论人卵巢癌组织和人卵巢癌细胞表达FPR和TLR9两受体;缺氧不仅上调卵巢癌细胞上两受体的表达,而且引起两受体的具有生物活性的化合物(配体)释放到细胞外。FPR和TLR9的激活在缺氧诱导卵巢癌细胞获得耐药性过程中发挥重要作用,这一作用可能与FPR或TLR9被激活引起MRP、P-gp、P53、Beclin1等耐药相关蛋白表达上调有关。FPR和TLR9有望成为化疗增敏的新靶点。