三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国海水养殖的主要蟹类品种之一,具重要的经济价值。盐度是三疣梭子蟹养殖中重要的环境因子之一,直接影响三疣梭子蟹生长、发育及存活。DNA甲基化修饰是最常见的表观遗传现象,能够直接影响基因活性,已成为近年来表观遗传学研究领域最为关注的热点之一。研究表明DNA甲基化在水产动物生长、发育、性逆转以及环境适应中发挥举足轻重的作用,然而,是否在甲壳动物盐度适应中具一定的作用尚未见报道。为解析DNA甲基化在三疣梭子蟹盐度适应中的功能,本论文主要设计两方面研究:1、首次克隆了具有维持基因组甲基化状态功能的三疣梭子蟹甲基转移酶基因(PtDNMT1),通过q RT-PCR分析了其在三疣梭子蟹不同组织中的表达水平,并对其在盐度胁迫下的表达变化规律进行了研究,初步探讨DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中是否发挥一定功能。2、通过先进的Methyl-RAD技术,揭示盐胁迫前后三疣梭子蟹鳃组织中的DNA甲基化变化规律,从表观遗传学角度分析甲基化修饰在盐度适应过程中的功能,主要研究结果如下:1.PtDNMT1基因的克隆及盐度胁迫中的表达分析甲基转移酶基因(DNMT1)是维持基因组甲基化状态的重要基因,该基因具有特异性的N末端结构域和保守的C末端催化结构域,DNA甲基化由DNA甲基转移酶家族共同催化而成,为研究DNMT1基因在三疣梭子蟹盐度适应中的功能作用,本实验利用SMART-RACE技术成功克隆出三疣梭子蟹甲基转移酶(PtDNMT1)基因。PtDNMT1基因c DNA序列全长5919bp,包括4833bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15k D,理论等电点为4.68。结构预测发现PtDNMT1有两个特殊的结构域,分别是zf-CXXC锌指结构域和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域,进化树分析显示PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现:PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律:发现胁迫6h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12h(4倍),随后逐步下降,在72h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24h),且上调倍数相对高于鳃(8倍);低盐胁迫后PtDNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72h。该部分研究结果表明:盐度胁迫显著改变了PtDNMT1基因的表达模式,暗示DNA甲基化可能在盐度适应中发挥一定的功能。2.盐度胁迫下三疣梭子蟹鳃组织DNA甲基化分析与验证DNA甲基化是表观遗传学最为重要的一种调控方式,为研究DNA甲基化在三疣梭子蟹盐度适应中的功能,本实验利用先进的Methyl RAD技术,对盐度胁迫后0h、12h和72h的三疣梭子蟹鳃组织材料进行DNA甲基化检测,共发现CCGG模式的甲基化位点93,418个,CCWGG模式的甲基化位点44,218个。从中挑选5个甲基化位点,通过亚硫酸盐方法进行验证,验证准确率为100%。通过比较盐度胁迫前后鳃组织DNA甲基化位点的测序深度,共筛选出CCGG模式差异表达的甲基化位点共7,575个,CCWGG模式差异表达的甲基化位点923个。根据表达规律将差异表达甲基化位点归为4类表达模式类型,其中最主要的类型为盐度胁迫后先上调之后下调的表达模式,占总差异位点的67%。挑选7个差异的甲基化位点通过q PCR技术进行检测,结果显示甲基化程度高的位点相对应的m RNA表达均显著下调。进一步分析发现1,086个差异DNA甲基化位点有明确的基因注释信息。GO富集分析结果显示,差异的甲基化位点主要富集于生长繁殖、代谢、细胞过程、生物调节及免疫等过程。该部分研究结果表明:1、利用Methyl RAD技术可以准确、高效的分析三疣梭子蟹鳃组织中的甲基化变化规律;2、DNA甲基化在三疣梭子蟹鳃组织进行盐度适应的过程中发挥重要功能。