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油棕(Elaeis guineensis Jacg),属棕榈科油棕,多年生常绿乔木,为典型的热带油料植物。油棕中果皮是目前所报道的含油率最高的植物组织类型。在我国,油棕主要分布在海南地区,是海南最具特色的热带经济作物之一。MicroRNA(miRNAs)是一类内源性、非编码的单链小RNA,在植物生长发育过程中起重要的调控作用。本实验以前期大规模转录组测序中筛选得到的油棕microRNA5179(Eg-miR5179)作为研究对象,通过表达载体的构建、转基因、转录组测序、生物信息学分析和代谢产物含量分析的方法深入解析了 Eg-miR5179在植物中的分子作用机制,取得的主要研究结果如下:1.以野生型拟南芥miR319前体(pre-miR319a)为骨架,通过置换PCR将Eg-miR5179的成熟体及星号序列成功替换到拟南芥miR319骨架中,通过拟南芥中对其miR319的自身切割作用,从而获得成熟体Eg-miR5179;构建植物表达载体35S:pHQSN-miR5179,并通过农杆菌转入模式植物拟南芥中;对获得的转基因植株中Eg-miR5179的表达分析表明:与对照相比Eg-miR5179在转基因植株叶片中的表达量高达3000倍以上,在花和角果中的表达量平均为2-10倍;对转基因拟南芥花期和花的外观形态观察表明:转Eg-miR5179拟南芥的花期较野生型提前5-10天。而花的结构和形态没有明显差异。2.为了全面的了解Eg-miR5179对拟南芥生长发育的影响,通过RNA-Seq的方法对转基因拟南芥及其野生型对照的三个组织中(花、叶片、角果)的差异基因进行聚类分析。结果表明:叶片中的差异基因数量明显多于花和角果,且大部分为下调基因。进一步通过GO和Pathway分析表明,不同组织类型中差异基因均显著的集中在生物胁迫、次生代谢和油脂合成相关的代谢通路上,预示着Eg-miR5179在转基因植株中的过表达系统的影响了植物中的一系列代谢途径。3.为了解析Eg-miR5179在转基因拟南芥中的分子调控机制,通过在线预测Eg-miR5179和5’ RACE相结合的方法对Eg-miR5179的靶基因进行预测和切割验证。结果表明:NAD+Transporter 1(NDT1)与Eg-miR5179在拟南芥中互为靶向关系。通过针对Eg-miR5179靶基因NDT1进行荧光定量(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析表明:与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥叶片和角果中NDT1的表达量随着Eg-miR5179的表达量升高而显著性下降。转基因拟南芥细胞中 NAD+(Nicotinamide adenine dinucleotide,辅酶 I)及 NADH(Reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,还原型辅酶 I)的含量分析也进一步验证了 Eg-miR5179对NDT1的抑制作用。一系列的研究结果可以证明,Eg-miR5179的过表达通过对靶基因NAD+Transporter 1(NDT1)的切割导致NAD+和NADH含量的降低,从而对转基因植物中涉及NAD/NADH代谢途径产生影响。4.为了证明NDT1的下调对拟南芥生长发育及代谢途径的影响,同时进一步验证生物信息学分析结果,对野生型和转基因拟南芥中的淀粉含量、总油脂的含量和脂肪酸种类、类黄酮含量和种类进行分析。结果表明:转基因拟南芥中的淀粉含量显著下降,油脂总量显著升高,油酸相对含量极显著(p<0.01)降低,而亚麻酸含量则极显著(p<0.01)升高;类黄酮中A10、A11、A33三种物质的含量骤减。综上所述:在转基因拟南芥植株中Eg-miR5179通过对其靶基因NDT1的转录抑制作用,显著降低了转基因植株细胞中NAD和NADH的含量,并最终影响到一系列与NAD/NADH相关的生物学过程。本研究的结果将为进一步了解和认识植物特别是油棕中miRNA的的分子生物学功能提供重要的研究基础。