布鲁氏菌(Brucella)是一种重要的人畜共患病病原体。根据种属及生化特性等差异,布鲁氏菌可分为10个种,猪种布鲁氏菌(B.suis)是其中较为重要的致病种之一,对家畜健康养殖和人类健康造成严重威胁。据世界卫生组织统计,全球每年有将近50万人感染布鲁氏菌,但时至今日布鲁氏菌的致病机制仍不十分清楚。为了能从分子水平解析猪种布鲁氏菌感染宿主的致病机制,本研究采用RNA-seq技术和比较基因组分析,对猪种布鲁氏菌强弱毒株体外感染细胞的转录组进行研究,并进一步对发现的与毒力相关的重要差异性基因进行小鼠体内感染试验验证。本研究首次采用转录组学方法,比较系统地研究了与猪种布鲁氏菌感染或毒力相关的基因,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制奠定了基础。1猪种布鲁氏菌强弱毒株小鼠巨噬细胞感染模型的建立及转录组测序分析本研究首先构建了布鲁氏菌参考强毒株(S1330株)和弱毒疫苗株(S2株)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型:布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞以MOI=200进行感染,能在感染细胞体内不断增殖,48h后S1330株和S2株均在宿主细胞内达到了增殖高峰,随后开始下降。分别提取S1330株和S2株分别感染巨噬细胞48h的RNA,以及未感染细菌的对照细胞RNA,构建cDNA文库。通过RNA-seq技术筛选布鲁氏菌感染组与未感染对照组RAW264.7细胞的差异表达基因,以及S1330株和S2株感染细胞之间的差异表达基因。结果与对照组相比,S2感染组细胞有8606个基因表达出现了显著变化;S1330感染组细胞有8889个基因表达出现了显著变化;S2与S1330感染组之间有440个基因表达出现了显著变化。对这些差异表达基因进行GO和Pathway分析,发现S2感染组与对照组、S1330感染组与对照组细胞的差异表达基因分析结果基本一致,功能上这些差异基因与DNA转录、修复,细胞的分裂、凋亡有关,并主要富集在溶酶体、蛋白酶体,以及与疾病感染相关的信号通路。S2感染组与S1330感染组的差异基因分析结果表明差异基因与固有免疫、吞噬和识别作用、炎症反应、脂多糖诱导的细胞应答、肿瘤坏死因子生物合成正调控等有关,主要富集在癌症转录失调、NF-kappaB、内质网蛋白加工、吞噬体、Toll样受体等信号通路。进一步对S2感染组与S1330感染组的差异基因进行基因共表达网络分析,分别筛选出10个和26个核心基因,这些核心基因主要在固有免疫、炎症反应、RNA拼接、蛋白质转运等方面发挥作用。2猪种布鲁氏菌强弱毒株小鼠感染模型的建立及固有免疫相关基因的转录水平分析通过RNA-seq发现,S2感染细胞与S1330感染细胞的转录表达差异基因显著富集在固有免疫功能上。为了研究与固有免疫相关的基因在感染动物体内的转录水平差异,建立S2株和S1330株感染BALB/c小鼠模型。分别分析S2株和S1330株感染的小鼠7d、14d、21d、28d后脾细胞RNA中与固有免疫相关的13个基因转录水平变化,并同时监测脾脏含菌量、血清抗体水平等相关参数的变化。结果发现,相比于对照组,13 个基因中有 6 个基因(1123a、Clec4a2、Tmem173、Clec5a、Fcgr1、Cfp)在 S2 感染小鼠与S1330感染小鼠体内均出现了差异表达,说明这些基因与布鲁氏菌感染宿主的过程的有关。相比于强毒S1330感染组,13个基因中除了 3个基因(C1rb、Nlrp10、Irf7),其余10个基因在疫苗株S2感染小鼠体内也都出现了差异表达,这10个基因的差异表达可能与宿主抵抗不同毒力布鲁氏菌的感染有关。脾脏含菌量监测结果显示,S2感染小鼠后脾脏含菌量从7d开始逐步下降,28d分离不到细菌;S1330感染小鼠后脾脏含菌量在感染21d最低,28d又明显升高。在血清抗体水平上,S2感染小鼠和S1330感染小鼠的血清抗体均呈逐步上升趋势。3猪种布鲁氏菌S2株和S1330株比较基因组学及差异基因转录水平分析对布鲁氏菌S2株和S1330株进行比较基因组分析,结果发现共有54个基因编码区的差异位点,其中30个位于染色体Ⅰ,24个位于染色体Ⅱ。这些差异基因有7个为小片段的碱基插入或缺失,47个为单个核苷酸的突变。对其中35个可能引起蛋白质结构、化学特性等发生改变的差异基因采用荧光定量PCR对其在不同生长条件下(培养基,及易感细胞)的转录水平进行分析,结果显示,相较于S1330株,S2株的7个插入/缺失基因中,有4个基因在培养基上或感染细胞内存在显著差异表达,28个单个核苷酸突变基因中则有10个基因在培养基和感染细胞内环境下均存在显著差异表达,这些差异表达基因的功能不一。根据基因的功能注释,差异表达基因Fis,其编码的FIS蛋白是一个核酸结合蛋白,是细菌的全局调控因子,可以参与到基因组结构与基因调控等过程,同时还对细菌的毒力基因进行调控,推测Fis蛋白的差异表达也许是布鲁氏菌S2株毒力降低的重要因素,其它与代谢相关的差异基因可能通过影响布鲁氏菌S2株的代谢途径而降低其毒力。