论文部分内容阅读
目的：探讨RNF135基因与胶质母细胞瘤发生、发展及预后的联系,并通过体内及体外实验研究RNF135基因对胶质母细胞瘤细胞U87的增殖、迁移及细胞周期的影响以及RNF135基因对U87细胞作用的机制,为胶质母细胞瘤提供新的基因治疗靶点。方法：首先对28例胶质瘤组织和12例正常的脑组织采用实时定量PCR与Western Blot实验检测组织中RNF135基因的表达差异。采用免疫组化实验比较123例胶质瘤和12例正常脑组织中RNF135蛋白的表达情况,(标本来源2004年7月到2009年6月,在大连医科大学附属第一医院手术的胶质瘤患者,正常脑组织为外伤、脑出血手术患者术区周边非功能区脑组织,所有标本获得都经过大连医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准),用统计学分析RNF135基因表达与患者年龄、性别、胶质瘤病理组织类型、预后及生存时间是否有相关性。然后通过构建shRNF135稳转的U87胶质母细胞瘤细胞系,研究RNF135基因对胶质母细胞瘤细胞U87增殖、迁移及细胞周期的影响及机制。通过使用慢病毒包装shRNA转染U87细胞对RNF135基因进行沉默,在体外建立稳定低表达RNF135基因的U87细胞系,同时通过慢病毒包装LVTHMGFP转染U87细胞作为对照组,慢病毒转完后通过流式细胞术筛选转染成功的细胞继续培养,培养的细胞用实时定量PCR与Western Blot实验验证RNF135基因的表达以确定稳定低表达RNF135基因的U87细胞系模型建立成功。实时定量PCR与Western Blot实验验证成功后首先检测干扰RNF135基因表达对U87细胞增殖的影响,细胞活性用MTT实验检测,通过划痕实验与Boyden小室迁移实验验证干扰RNF135表达后U87细胞迁移能力的变化情况。利用Western Blot实验验证RNF135基因与细胞通路p38及ERK之间的关系,利用细胞周期实验解释RNF135低表达对细胞周期的影响,通过Western Blot实验检测细胞周期相关蛋白的表达情况。最后通过荷瘤裸鼠模型在体内验证干扰RNF135基因表达对U87细胞在裸鼠体内成瘤的影响。结果：临床病例的统计分析表明RNF135基因与胶质瘤患者预后及生存时间均有明显的相关性。在所有调查的123例胶质瘤患者当中,RNF135基因明显高表达。在小于50岁的63名胶质瘤患者中RNF135基因高表达的概率为69.8%略微低于50岁以上的60名患者中RNF135基因高表达的概率(70%)。在73名女性胶质瘤患者中RNF135基因高表达的概率为74%,而在50名男性胶质瘤患者中RNF135基因高表达的概率为63%,女性患者的概率略微高于男性患者的概率。在9名少突胶质瘤患者中RNF135基因高表达的概率为77.8%,在60名间变性星型细胞瘤患者中RNF135基因高表达的概率为60%而在40名胶质母细胞瘤的患者中RNF135基因高表达的概率也为60%。按世界卫生组织对胶质瘤恶性程度的分类来看,恶性程度越高的胶质瘤中RNF135基因高表达的概率越高。Ⅲ和Ⅳ级的恶性胶质瘤患者的RNF135基因高表达的概率78%明显高于Ⅰ和Ⅱ级的恶性胶质瘤患者中RNF135基因高表达的概率34.8%。甚至Ⅰ和Ⅱ级的恶性胶质瘤患者中RNF135基因低表达的概率为65.2%,远高于RNF135基因高表达的概率22%。经SPSS统计分析发现,胶质瘤中RNF135的表达情况与患者性别、年龄、病理类型没有相关性,P值分别为0.985、0.236和0.766。WHO胶质瘤病理分级中,Ⅱ和Ⅳ级病理中的RNF135表达较I和II级的高,经统计学分析,p<0.05。综合以上实验结果可知,胶质瘤的恶性程度与RNF135的异常表达情况相关。高恶性程度的胶质瘤更容易发生RNF135基因的高表达。而Ⅲ和Ⅳ级的恶性胶质瘤,尤其是Ⅳ级恶性胶质瘤(多形性胶质母细胞瘤)往往预后很差而且患者生存时间很短。因此RNF135基因与胶质瘤的发生与预后均有密切的联系。同样的,在体外实验中我们发现RNF135基因在胶质瘤组织中的表达明显高于正常脑组织。我们用Western blot方法,分析在28个胶质瘤样本中RNF135蛋白表达量,明显高于正常的脑组织样本中RNF135蛋白表达量。以上结果说明胶质瘤细胞尤其是Ⅲ和Ⅳ级的恶性胶质瘤细胞往往发生RNF135基因程高表达。这种高表达不仅表现在RNF135基因的mRNA水平,而且蛋白水平也表现出一致的结果。在用慢病毒转染shRNA干扰RNF135基因在U87细胞中的表达后,实时定量PCR显示RNF135基因的mRNA表达水平及Western Blot实验显示RNF135基因的蛋白较空载对照组的明显降低,p<0.05统计学有意义。以上的实时定量PCR结果与Western Blot实验表明稳定低表达RNF135基因的U87细胞系建立成功。RNF135基因被干扰后U87细胞的增殖速度明显低于对照组,这说明高表达的RNF135基因有助于U87细胞的增殖。而划痕实验与Boyden小室迁移实验同时显示RNF135基因被干扰后U87细胞的迁移速度明显低于对照组,这说明高表达的RNF135基因有助于U87细胞的迁移。Western Blot实验显示稳定低表达RNF135基因的U87细胞中的Erkl/2及P-Erkl/2的表达量显著降低而p38及P-p38的表达量没有明显变化,这说明干扰RNF135基因后对U87细胞产生的抑制功能很可能是通过抑制ERK的磷酸化来实现的。细胞周期实验表明干扰RNF135基因会引起U87细胞阻滞在G0/G1期,这说明干扰RNF135基因是通过阻滞细胞周期从而抑制细胞增殖。而对细胞周期相关蛋白的Western Blot实验的结果显示,干扰RNF135基因后细胞细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4的表达降低,而细胞周期抑制蛋白p27和p21的表达增多从而导致细胞周期阻滞在G0/GI期。荷瘤裸鼠实验中稳定低表达RNF135基因的U87细胞所成的瘤块明显小于对照组。说明干扰RNF135基因在裸鼠体内抑制U87细胞的增殖。结论：RNF135基因与胶质瘤的发生与预后均有密切的联系,干扰RNF135基因可以使U87细胞阻滞在G0/G1期从而抑制细胞增殖及细胞的迁移能力。干扰RNF135基因后对U87细胞产生的抑制作用很可能是通过抑制ERK的磷酸化实现的,干扰RNF135基因通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4并上调细胞周期抑制蛋白p27和p21的表达从而导致细胞周期阻滞在G0/G1期,以上的研究表明RNF135基因有望作为治疗胶质母细胞瘤的新靶点。