南方红豆杉细胞悬浮培养体系建立及培养条件优化

来源 :江西农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:shyan
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本试验以南方红豆杉一年生枝条诱导愈伤组织,建立细胞悬浮培养体系;分析悬浮细胞生长、紫杉醇积累动力学关系及主要营养成分的变化;同时探讨了理化因子对悬浮细胞生长及紫杉醇含量的影响。主要研究结果如下:1.从消毒组合、植物生长调节剂浓度与配比等因素,设计了外植体消毒方案及愈伤组织诱导方法;通过单因素和正交试验,筛选和优化南方红豆杉细胞悬浮培养的培养基种类、细胞接种量、培养基初始pH、植物生长调节剂种类及配比等,建立南方红豆杉细胞悬浮培养体系。结果表明,最适的消毒方式为75%酒精浸泡0.5 min后,再用0.1%氯化汞浸泡8 min;愈伤组织诱导固体培养基以MS+1.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+1.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖为最佳。适合南方红豆杉细胞悬浮培养的最佳培养基配方为:B5+0.4 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA+1.2 mg/L 6-KT+30 g/L蔗糖,细胞最佳接种量为0.09 g/mL,初始pH为5.8;在27 d的培养周期内,悬浮培养的南方红豆杉细胞的生长曲线呈“S”型,第15 d时细胞鲜重达到最大值,为7.66 g/(30 mL)。2.采用超声波提取法从南方红豆杉愈伤组织中提取紫杉醇,通过单因素和正交实验考察了溶剂、级数、温度、时间、料液比对南方红豆杉细胞愈伤组织中紫杉醇提取的影响。结果表明,南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇的最佳提取条件是:溶剂为甲醇,提取3次,温度55℃、每次提取30 min、料液比1:40。3.研究了南方红豆杉悬浮培养过程中细胞生长和紫杉醇积累的动力学关系及主要营养成分的变化,建立动力学模型。结果表明,在27 d的培养周期内,培养液中的总糖、磷元素、铵态氮、硝态氮在细胞培养的第18 d基本被消耗完;动力学拟合表明,南方红豆杉悬浮培养细胞生长符合Logistic生长模型,最大比生长速率为0.14365 d-1,底物消耗和紫杉醇合成可用Luedeking-Piret模型描述,悬浮细胞生长与紫杉醇积累属于部分生长偶联型。4.研究了碳源、氮源、磷源、Ca2+和Mg2+浓度对南方红豆杉悬浮培养细胞生长及紫杉醇合成的影响。结果表明,蔗糖浓度为30 g/L时,细胞生长较好,其浓度为40 g/L时,有利于紫杉醇的合成;铵态氮与硝态氮比例为3:24时,有利于细胞生长和紫杉醇合成;总氮浓度较高时有利于细胞生长,而低溶度氮有利于紫杉醇合成;磷源浓度为1 mmol/L时有利于细胞生长,磷源浓度为0.25 mmol/L时有利于紫杉醇的合成;CaCl2浓度为2 mmol/L有利于细胞生长和紫杉醇合成;MgSO4浓度为3 mmol/L时最有利于细胞生长,MgSO4浓度为2 mmol/L时有利于紫杉醇合成。
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