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背景Zika病毒与新生儿小头症存在因果关系,目前已经迅速扩散到数十个国家和地区,构成国际关注的突发公共卫生事件。Zika病毒有两个基因型:非洲亚型和亚洲亚型,美洲爆发的Zika病毒属于后者。Zika病毒为包膜病毒,包膜上具有M和E两种蛋白,其中E蛋白是参与受体结合和融合的主要蛋白,且E蛋白存在的唯一N-糖基化位点Asn-154能够影响这个过程。本次流行及一些非洲亚型Zika病毒E蛋白存在潜在糖基化位点,然而部分非洲亚型Zika病毒此糖基化位点缺失。我国也有输入性Zika病毒的报道。目的本研究目的是通过一株本次流行的输入性Zika病毒毒株ZKC2/2016在鼠脑连续传代,筛选导致Zika病毒毒力增强的基因突变,并进一步分析相关突变导致致病力增强的机制,为Zika病毒致病因子的深入研究及病毒致病机理的研究提供理论基础和实验依据。进而为Zika疫苗的研制提供研究思路和理论基础,同时为特效药物的开发设计指明研究方向,提供有根据的针对性强的作用靶点。方法1.建立Zika病毒鼠适应株。(1)利用Zika毒株ZKC2/2016在新生1日龄BALB/c乳鼠脑内连续传代,筛选致疾病表型增强的Zika毒株;(2)通过二代测序获得ZKC2/2016全基因组序列,根据其序列设计扩增ZKC2/2016全基因组的引物;(3)扩增每代Zika全基因组序列,利用SeqMan拼接各代病毒全基因组序列,并利用MEGA比对各代病毒全基因组序列确定突变位点;(4)利用噬斑实验纯化突变的病毒3次,进一步对纯化病毒全基因组测序,确保纯化过程中无基因突变,并利用Bankit上传相关序列;(5)下载Genbank Zika全基因组序列,利用MEGA对下载序列和突变Zika序列比对和遗传进化分析;(6)通过在线工具SWISS-MODEL预测基因突变位点相应蛋白结构;(7)利用蛋白结构分析软件PyMol和Chimera叠加突变前后蛋白结构,分析突变位点对相应蛋白结构的影响。2.适应毒株在乳鼠中神经毒力的研究。(1)建立Zika病毒荧光定量RT-PCR检测方法,利用体外转录的的方法制备RNA参考品;(2)利用上一部分纯化基因突变Zika病毒毒株ZKC2P4与ZKC2P6,在1日龄BALB/c乳鼠脑内大量扩增,建立病毒库,并通过荧光定量PCR定量;(3)利用1日龄BALB/c乳鼠比较脑内接种相同拷贝ZKC2P4和ZKC2P6后乳鼠体重变化及生存率差异;(4)利用1日龄BALB/c乳鼠,比较两组小鼠Zika病毒靶器官脑重、脑宽、脑室宽及大脑皮层厚度,(5)利用1日龄BALB/c乳鼠,比较两组小鼠脑各部分(嗅球、大脑皮层、海马、小脑、脑干)及颈脊髓的病理学改变;(6)利用1日龄BALB/c乳鼠,通过荧光定量PCR测定Zika病毒RNA拷贝比较ZKC2P4和ZKC2P6在乳鼠脑内复制差异,通过免疫荧光测定脑组织中病毒颗粒含量;及在非洲绿猴肾细胞Vero和人神经母细胞瘤细胞SY5Y的复制曲线,(6)通过免疫荧光检测活化Cas3,比较ZKC2P6与ZKC2P4诱导细胞凋亡的差异,并利用免疫印迹定量比较活化Cas3和裂解PARP的表达差异。结果1.筛选神经毒力增强毒株ZKC2P6。(1)ZKC2/2016在1日龄BALB/c乳鼠传到第5代开始出现毒力增强的现象,随后传至第8代都有相同的症状;(2)1-8代全基因组测序及比对,发现在第4代(ZKC2P4)结构蛋白PrM和非结构蛋白NS5各有一个点突变,ZKC2P5-ZKC2P8序列相同在ZKC2P4的基础上E蛋白Asn-154附近发生7个氨基酸缺失;(3)下载Genbank中213个Zika病毒全基因组序列,序列比对发现有11个毒株在E蛋白Asn-154附近有4-7个氨基酸的缺失,有7个毒株E蛋白156位置为异亮氨酸(I)破坏糖基化基序NDT;(4)发现另外11株缺失Zika病毒均属于非洲亚型,亚洲亚型Zika病毒株中仅有ZKC2P6发生氨基酸缺失;(5)ZKC2/2016、ZKC2P4和ZKC2P6与7个氨基酸替换毒株全基因组序列及E蛋白核苷酸序列进行遗传进化分析,发现仅有ZKC2P6属于本次流行Zika病毒;(6)结构预测发现7个氨基酸缺失影响Zika病毒E蛋白结构域DI的局部α螺旋,使E蛋白向外伸展的“150环”缩短,使E蛋白二聚体的融合环暴露。2.确证基因突变Zika病毒毒株神经毒性增强。(1)临床表现:与ZKC2P4组相比,ZKC2P6组乳鼠表现出更严重的疾病状态,例如更早的出现体重下降(P<0.05)和乳鼠死亡(P<0.05),及胃排空、活动减少和后肢跛足;(2)脑表观变化:与ZKC2P4组相比,ZKC2P6组BALB/c乳鼠表现出乳鼠脑重小(P<0.05)、脑宽及脑室宽变小;(3)皮层及脑室:与ZKC2P4组相比,ZKC2P6组BALB/c乳鼠大脑皮层变薄和脑室扩大;(4)病理学检查:ZKC2P6感染导致脑各部分(嗅球、大脑皮层、海马、小脑、脑干)及颈脊髓的大量神经细胞和胶质细胞死亡;(5)病毒复制:1)ZKC2P6在乳鼠脑内复制速度比ZKC2P4快,①攻毒后第3和5天ZKC2P6病毒RNA分别是ZKC2P4的125倍和4倍,差异均有统计学意义(P<0.05),②免疫荧光检测攻毒后第5天鼠脑,ZKC2P6病毒颗粒明显多于ZKC2P4,2)ZKC2P6在人神经母细胞瘤细胞SY5Y复制速度比ZKC2P4快,攻毒后48和72个小时ZKC2P6病毒RNA分别是ZKC2P4的5倍和4.7倍。(6)诱导凋亡:ZKC2P6能够加速神经细胞和胶质细胞凋亡,免疫荧光检测5dpi ZKC2P6组大脑皮层活化Cas3明显多于ZKC2P4,免疫印迹检测活化Cas3及裂解的PARP均多于ZKC2P4组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.通过鼠脑连续传代,成功构建了 E蛋白糖基化位点缺失的Zika病毒鼠适应株ZKC2P6。2.与ZKC2P4相比,ZKC2P6在神经细胞内复制能力增强、导致神经细胞凋亡加速,临床表现为小鼠疾病进程加速。3.总的来说,E蛋白糖基化位点的缺失增强了 Zika病毒的神经毒力。