论文部分内容阅读
1背景与目的电离辐射在人们生产、生活的各个领域得到越来越广泛的应用,但放射线在造福人类的同时,过量照射能对人体造成有害的影响。快速的进行剂量估算显得尤为重要。目前应用的剂量估算方法有物理方法和生物方法,生物方法主要采用一些生物剂量指标估算受照剂量,最常用的生物剂量估算方法是外周血淋巴细胞染色体畸变分析。然而,这种方法也存在不能早期、快速和高通量估算剂量的缺陷。为此,诸多学者致力于寻求能够早期、快速和高通量的生物剂量估算方法。nm23基因（non-metastasis gene）是Steeg PS等于1988年通过消减杂交法从转移潜力不同的K-1735鼠黑色素瘤细胞中分离出来的第一个肿瘤转移抑制基因（metastasis suppressor gene）。该基因广泛存在于包括细菌、酵母、植物、果蝇、鼠和人类在内的多种生物物种中,是一个具有高度同源性的保守基因家族。目前,已发现的人类nm23家族成员达到了9个,分别是nm23-H1、nm23-H2、DR-nm23、nm23-H4、nm23-H5、nm23-H6、nm23-H7、nm23-H8、nm23-H9。其中编码核苷二磷酸激酶A（nucleoside diphosphate kinase A,NDPK-A）的nm23-H1基因研究最多,其在肿瘤的发生、发展及其转移中有重要作用。据报道nm23-H1基因的高表达与许多实体肿瘤的转移呈负相关,与肿瘤病人的预后呈正相关。有关电离辐射对nm23-H1基因表达影响的研究报道较少,主要集中在肿瘤放疗后该基因的表达变化,且其表达增高者预后较好,表明电离辐射对nm23基因表达变化有一定影响。但有关电离辐射离体照射对nm23-H1基因表达的影响尚缺系统研究。为此,本课题利用60Coγ射线离体照射培养的人肺非小细胞癌细胞株H446,分别从mRNA和蛋白水平研究不同剂量γ射线对该细胞株nm23-H1基因表达变化的影响,探讨nm23-H1基因的表达变化作为电离辐射生物标志物的可行性,为建立新型电离辐射分子生物剂量计研究奠定实验基础。2方法2.1细胞的培养及处理人肺非小细胞癌细胞株H446置RPMI1640培养基中培养,取对数生长期细胞置60Co（钴60）放射治疗机上单次照射,分别接受0、1、2、3、4和5Gy剂量的γ射线照射,继续培养细胞0h、6h、24h和48h后收集细胞,备用。并以0Gy照射组做为对照组。2.2细胞总RNA的提取及反转录采用Trizol-氯仿-异丙醇方法提取细胞中的总RNA。测提取总RNA纯度及含量。使用反转录试剂盒进行逆转录反应。反转录得到的cDNA在-20℃保存,备用。2.3细胞总蛋白的提取及处理将收集的细胞于冰上加入PMSF,然后再加入细胞裂解液,裂解30min。于4℃,12000g离心5min。取上清分装于0.5ml离心管中。在λ为595nm处,用BSA做标准曲线,测定总蛋白含量。然后将蛋白与2×上样缓冲液混匀后100℃煮沸10min,离心,冻存备用。2.4 RT-PCR检测nm23-H1 mRNA的表达以β-actin基因作为内参照基因,以逆转录得到的cDNA用作模板进行PCR反应。取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察结果和拍照,并进行图像处理,计算电泳条带吸光度值作为PCR产物的相对含量。用nm23-H1吸光度与β-actin吸光度的比值表示nm23-H1 mRNA的相对表达量。2.5 Western blot测定nm23-H1蛋白的表达水平每个泳道上样量相同进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后,将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上,转移上蛋白的硝酸纤维素膜经封闭液封闭后,分别顺序与一抗、二抗杂交,最后用DAB进行显色。用凝胶成像系统进行图像处理,分析目标的分子量和净光密度值。2.6统计学处理用SPSS 12.0对资料进行重复测量资料的方差分析,剂量变化趋势采用等级资料相关性分析。检验水准取α=0.05。3结果3.1辐射处理各组nm23-H1基因mRNA的表达量均明显低于对照组（P＜0.05）;辐射处理后在0～5Gy剂量范围内nm23-H1随剂量的增高有降低趋势（P＜0.05）,且与剂量之间呈负相关（r≥0.785,P＜0.05）;测定时间和剂量之间有交互作用（P＜0.05）;照射后,mRNA的量在0～24h内逐渐增高,48h时有所降低,而对照组未见其随时间变化趋势。3.2辐射处理后在0～5Gy剂量范围内nm23-H1蛋白表达水平随剂量增加有降低的趋势（P＜0.05）,且与剂量之间呈负相关（r≥0.66,P＜0.05）;对照组表达水平明显高于处理各组（P＜0.05）;测定时间和剂量之间存在交互作用（P＜0.05）;蛋白表达在0和6h之间没有显著差别（P＜0.05）,24h达高峰,48h时有所降低,对照组不随时间变化。4结论4.1电离辐射能够降低H446细胞nm23-H1基因表达水平,随电离辐射剂量的增加而逐渐降低,且有一定的剂量效应关系。4.2 Nm23-H1蛋白可能不是分泌型蛋白。4.3 Nm23-H1基因表达变化作为电离辐射生物标志有一定的可行性。