柠檬皮中柠檬苦素生物活性研究

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柠檬苦素是柠檬中重要的功能活性物质之一。柠檬苦素具有多种生物活性,如抗氧化、抑菌、镇痛消炎及抗肿瘤等。本文研究了柠檬果皮中柠檬苦素对根霉、青霉及黑曲霉三种霉菌的抑菌特性及其抑菌机理;研究了柠檬苦素的抗氧化性及抗肿瘤性;探讨了柠檬苦素的纯化工艺。研究结果为进一步开发柠檬的营养保健价值、提高柠檬的高效利用提供理论依据。采用牛津杯法与动态测定菌种OD值法研究柠檬苦素对黑曲霉、根霉和青霉的抑菌作用。柠檬皮中柠檬苦素提取液对黑曲霉、青霉的MIC为625μg/m L;对根霉的MIC为1250μg/m L。柠檬苦素对黑曲霉、青霉的MFC为5000μg/m L;对根霉的MFC为2500μg/m L。柠檬苦素提取液对三种霉菌均有较强抑制作用。研究温度、紫外照射、pH、明胶、铁离子(氧化态Fe3+和还原态Fe2+)五个因素对柠檬苦素抑菌性的影响。结果显示,温度、明胶对柠檬苦素的抑菌作用影响较小;紫外照射及铁离子浓度对柠檬苦素的抑菌作用影响较大;pH对柠檬苦素的抑菌作用影响最大,柠檬苦素在酸性条件下(pH2-6)其抑菌作用最佳。采用孢子萌发率、菌丝抑制率、电导率、蛋白质及扫描电镜五种指标研究柠檬苦素对黑曲霉、青霉及根霉的抑菌机理。低浓度的柠檬苦素即可抑制三种霉菌(黑曲霉、青霉:625μg/m L,根霉:312.5μg/m L)的生长,柠檬苦素对黑曲霉、青霉及根霉的抑菌作用是抑制而不是杀死。通过电导率、蛋白质及电镜分析证实柠檬苦素对黑曲霉、青霉及根霉的抑菌机理主要是通过破坏细胞壁的完整性,使细胞膜通透性增加,改变三种霉菌的正常代谢,从而抑制细菌的生长。采用DPPH自由基清除法(DPPH法)和铁还原比色法(FRAP法)来研究温度、光照、pH三个因素对柠檬苦素抗氧化作用的影响。温度、光照、pH对柠檬苦素抗氧化作用均有显著影响(p<0.05),但在不同pH条件下,柠檬苦素含量与其DPPH自由基清除能力呈现极显著的相关性(p<0.01),其他条件下均相关性不显著(p<0.05)。以柠檬苦素标准品为对照,以SMMC-7721、A549、Hep C2三种肿瘤细胞在24h、48h内的生长存活率曲线来考察柠檬皮中柠檬苦素的抗肿瘤性效果。柠檬皮中柠檬苦素对A549肿瘤细胞的抑制效果最佳,Hep C2次之,对SMMC-7721抑制作用最弱。柠檬苦素提取液对A549细胞抑制效果在24h及48h都优于标准品,且48h抑制作用的维护需要较高浓度。柠檬苦素提取液对Hep G2细胞抑制效果在24h次于标准品,在48h优于标准品,且48h抑制作用的维护需要较高浓度。柠檬苦素提取液与标准品对SMCC-7721细胞无论在24h或48h均无抑制效果,增加二者浓度并不能增强抑制作用。柠檬苦素对肿瘤细胞的抑制作用具有特异性(种类、作用时间)。以吸附率和解析率为指标在6种大孔树脂中筛选出最适合纯化柠檬苦素的大孔树脂XAD-16,研究不同上柱浓度、上样速度、洗脱剂浓度及洗脱速度对XAD-16大孔树脂动态吸附曲线影响。得到最佳上柱浓度为上样流速为0.5m L/min,最佳上柱浓度为2.135mg/m L,最佳洗脱剂为80%乙醇溶液,最佳洗脱流速为0.5m L/min。从二级质谱图解析柠檬皮中柠檬苦素提取液结构,发现两种柠檬苦素类似物配糖体-奥巴叩酮配糖体(obaunone glucoside)以及诺米林配糖体(nomilin glucoside)。
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