【摘 要】
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结直肠癌是高发病率,高死亡率的胃肠道肿瘤,严重威胁人类健康。丁酸梭菌是一种可以调节肠道紊乱的益生菌,近年来也被发现具有缓解炎症和辅助癌症治疗的作用。然而丁酸梭菌在结直肠癌中的作用和机制并不十分清楚。因此,我们设计实验,从体外细胞水平和体内动物实验两方面探索了丁酸梭菌对结直肠癌进展的作用以及丁酸梭菌发挥作用的机制,为丁酸梭菌辅助结直肠癌治疗提供理论支持。我们通过将丁酸梭菌,丁酸盐以及丁酸梭菌上清液与
【基金项目】
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国家自然科学基金(51972343,51937011); 中国癌症基金会北京希望马拉松专项基金(LC2020A24)
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结直肠癌是高发病率,高死亡率的胃肠道肿瘤,严重威胁人类健康。丁酸梭菌是一种可以调节肠道紊乱的益生菌,近年来也被发现具有缓解炎症和辅助癌症治疗的作用。然而丁酸梭菌在结直肠癌中的作用和机制并不十分清楚。因此,我们设计实验,从体外细胞水平和体内动物实验两方面探索了丁酸梭菌对结直肠癌进展的作用以及丁酸梭菌发挥作用的机制,为丁酸梭菌辅助结直肠癌治疗提供理论支持。我们通过将丁酸梭菌,丁酸盐以及丁酸梭菌上清液与结直肠癌细胞系共培养,使用MTT实验和细胞周期流式细胞术检测,在体外探索了丁酸梭菌对结直肠癌细胞增殖的影响。我们也使用C57BL/6J雄鼠构建了偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖酸钠(DSS)炎症相关结直肠癌小鼠模型,并在模型小鼠产生结肠息肉时将小鼠分为普通建模对照组和丁酸梭菌灌胃组。给予丁酸梭菌灌胃组模型小鼠每周三次丁酸梭菌灌胃(1×108集落形成单位(CFU))处理模型小鼠,共处理40天。我们还通过Ki-67免疫组化染色检测评估了模型小鼠结直肠癌组织中肿瘤细胞的增殖。结肠肿瘤组织内的肿瘤细胞的凋亡情况通过结肠肿瘤组织切片TUNEL染色评估。我们用酶联免疫吸附实验(ELISA)还对小鼠血浆IL-6和IL-10的水平进行了检测。通过对模型小鼠肠道微生物进行16S rDNA测序,我们也分析了丁酸梭菌处理后小鼠肠道微生物的变化。我们还通过荧光原位杂交(FISH)实验,用丁酸梭菌荧光标记探针对模型小鼠小肠和结肠肿瘤组织中的丁酸梭菌进行定位。最后,我们通过qRT-PCR和Western Blot实验在体内和体外检测了丁酸梭菌对结直肠癌髓系分化因子88(MyD88)和核转录因子κB(NF-κB)基因表达的影响。实验结果与结论如下:1)我们通过MTT实验和细胞周期流式细胞术检测发现,丁酸梭菌处理后结直肠癌细胞系的增殖受到抑制,细胞周期被阻滞在G2/M期。因此我们推断丁酸梭菌或许通过阻滞结直肠癌细胞的细胞周期从而抑制结直肠癌细胞的增殖。2)通过动物实验我们发现丁酸梭菌灌胃组模型小鼠肿瘤数目和肿瘤总体积以及结肠肿瘤组织Ki-67阳性率都低于对照组,且结肠肿瘤组织中凋亡细胞占比高于对照组。因此我们得出丁酸梭菌能抑制AOM/DSS小鼠结直肠癌的进展。3)通过对模型小鼠体重变化的持续观测以及对炎症相关指标的检测评估,我们发现丁酸梭菌灌胃组模型小鼠的体重一直高于对照组,并且我们通过对两组模型小鼠小肠切片H-E染色发现,对照组小鼠小肠固有层浆细胞浸润增加,隐窝不规则,表面结构改变。模型小鼠血浆ELISA检测结果显示,丁酸梭菌灌胃组模型小鼠血浆炎症因子IL-6的水平低于对照组,而抗炎因子IL-10的水平高于对照组。因此我们得出结论,丁酸梭菌能够缓解AOM/DSS模型小鼠的炎症状态。4)通过对模型小鼠肠道微生物16S rDNA测序分析,我们发现丁酸梭菌处理后,丁酸梭菌灌胃组小鼠肠道微生物多样性高于对照组,并且相较于对照组群落组成发生改变,形成了优势菌种,肠道微生物群落组成也发生改变。我们也通过FISH实验发现丁酸梭菌在模型小鼠小肠隐窝和结肠肿瘤组织中富集。这些结果表明丁酸梭菌能够增加模型小鼠肠道微生物多样性,改变肠道微生物结构。并且丁酸梭菌或许通过浸润到结肠肿瘤组织中,直接作用于结直肠癌细胞从而抑制肿瘤进展。5)通过将结直肠癌细胞系和丁酸梭菌共培养检测MyD88和NF-κB基因表达发现丁酸梭菌处理后结直肠癌细胞系MyD88和NF-κB基因表达降低。并且我们用模型小鼠结肠组织也检测了MyD88和NF-κB基因表达,发现丁酸梭菌灌胃组小鼠表达量低于对照组。因此我们推断丁酸梭菌能够抑制MyD88和NF-κB基因的表达,并且可能通过调节MyD88和NF-κB基因表达抑制结直肠癌的进展。综上所述,本研究在体内和体外验证了丁酸梭菌对结直肠癌的抑制作用,并且对其作用机制进行了初步的探索。
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