研究背景与目的血管性痴呆(vascular dementia,VaD)是一组由脑血管疾病导致的智能及认知功能障碍综合征,是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的引起痴呆的第二大最常见原因。Bowler等学者在90年代提出了血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCI)的概念,以期在脑血管病的早期阶段发现轻度的认知功能障碍,制定合适的治疗方案,延缓痴呆的发展进程。VCI这一概念几乎包含了脑血管疾病(cerebrovascular disease,CVD)对认知功能影响的方方面面,涵盖了早期阶段认知功能某一方面如语言的轻度障碍到广泛认知功能损害的痴呆综合征。随着我国老龄化人口的快速进展,VaD的发病率和患病率明显增加,给患者家庭和社会带来了沉重的负担,但迄今为止,其发病机制尚不明确,故缺乏有效的预防和治疗手段。因此,积极地探索和研究VaD的发病机理已成为当务之急。目前的研究结果表明,VaD的药物治疗及预防效果不明确。研究发现他汀类药物并没有提高脑缺血患者的脑血管反应性。另外,与安慰剂相比,阿司匹林和降压药对痴呆的发生发展并没有明显的延缓作用。相比与药物治疗,近几十年基于干细胞技术的细胞替代治疗引起了广泛的关注。在一项研究中,研究人员发现通过对脑缺血动物模型静脉输注人类骨髓CD34+干细胞,可以促进缺血病灶周围新生血管的形成,同时也促进了内源性神经祖细胞的迁移、成熟和功能性恢复。外源性干细胞替代治疗为脑缺血后的神经功能恢复提供了广阔的前景,但是对于其应用于临床治疗还需更多的基础实验支持,特别是长期的安全性和细胞采集以及输注等技术性关键问题还有待于进一步的研究。近年来,国内外的研究表明许多因素可以影响成年脑内内源性神经再生,些生长因子、神经递质可以促进内源性神经祖细胞增殖、迁移、分化和存活,改善脑缺血等损伤所致的神经功能障碍,为今后利用内源性神经祖细胞作为细胞替代治疗提供了可能,可以避免外源性细胞替代治疗所带来的安全性考虑和技术性难题。脑缺血后海马和侧脑室的神经再生是国内外的研究热点,对神经干细胞和神经祖细胞的存活、增殖和分化的基因调控的研究是该领域研究的核心问题。国内外的研究报道称,中药汤剂(人参养荣汤)、左旋丁苯酞、蒿本内酯等能促进海马齿状回(Dentate gyrus,DG)的颗粒细胞层下区(Subgranular zone,SGZ)的神经再生,使双侧颈总动脉永久性结扎术(bilateral permanent occlusion of the common carotid arteries,2VO)所致大鼠慢性脑缺血模型Morris水迷宫测试潜伏期显著缩短,从而改善慢性脑缺血所致认知功能障碍。虽然海马神经祖细胞可以从SGZ向颗粒细胞层迁移,但海马新生神经元在早期就到达它们最终的位置,新生细胞最远的迁移距离在50-100um范围内,而大部分似乎根本不迁移,仍然停留在SGZ,不能直接参与海马CA1神经元损伤修复。因此国内外的研究加强了对迁移能力较强的侧脑室背外侧壁的室下区(Subventricular zone,SVZ)的神经祖细胞的研究。以往研究表明,在正常啮齿动物的大脑,SVZ新生神经元大部分都凋亡了,存活下来的新生神经元沿着RMS(rostral migratory stream)迁移路径到达嗅球,并分化为球旁细胞和GABAergic颗粒细胞。但在脑缺血等损伤刺激下,侧脑室下区的神经祖细胞可以明显增多,并且可以向损伤部位迁移,分化为损伤部位的特定的神经元,但脑缺血等损伤所致的微环境的变化使得新生神经元形态结构生长障碍,不能有效地整合入损伤部位的神经电路参与功能修复,但这种形态结构的生长障碍可以在FGF-2等生长因子干预下恢复,提示脑缺血后功能缺陷的新生神经元能在外源性因素干预下恢复正常结构,并发挥功能性作用,改善脑缺血导致的神经功能障碍。因此急需寻找有效的手段促进SVZ神经祖细胞向神经元方向分化,提高其存活率,促进新生神经元向损伤部位迁移,从而增加利用内源性神经祖细胞作为细胞替代治疗的机会,有效地改善损伤所致的神经功能障碍。血管性痴呆(VaD)患者血清三碘甲状腺原氨酸(T3)和游离三碘甲状腺原氨酸(fT3)浓度显著低于未痴呆患者,而且轻、中、重度不同程度血管性痴呆患者之间血清T3和fT3水平也有显著差异,与阿尔茨海默病(AD)患者相比,VaD患者的f13水平也显著降低,非痴呆型血管性认知障碍(VCIND)患者的血清四碘甲状腺原氨酸(T4)和游离四碘甲状腺原氨酸(fT4)水平显著低于脑血管疾病(CVD)患者,CVD患者的血清T4和fI’4水平显著低于具有脑血管病危险因素的正常对照组,以上研究结果共同提示,血清甲状腺激素水平的异常与血管性痴呆的进行性发展过程密切相关,而且可能在脑血管病发生但未导致认知功能障碍的早期阶段就有血清甲状腺激素水平的异常,加强甲状腺激素与血管性痴呆之间关系以及机制等进一步的研究很有意义,可能为今后血管性痴呆的早期临床诊断和治疗提供线索。甲状腺激素(THs)对哺乳动物中枢神经系统的发育成熟至关重要,影响胚胎脑内神经元的增殖、分化,轴树突生长,髓鞘形成等各个过程。近年来THs对成年大脑的影响备受关注。研究发现THs水平异常严重影响成年大脑SGZ和SVZ两个区域神经祖细胞的增殖、迁移、分化等过程,提示成年甲状腺功能低下所致的认知功能障碍可能与THs影响SGZ和SVZ两个区域的神经再生有关。多项研究通过对基因敲除模型和MMI/PTU导致的甲状腺功能低下模型的研究发现,不管是在胚胎和幼年大脑,还是对于成年大脑而言,甲状腺素的缺乏可以影响神经元的增殖、分化、迁移和凋亡等各个方面,使轴突树突生长、突触形成和髓鞘形成等过程受损,而重新补充甲状腺激素可以逆转甲状腺素缺乏的负性作用,但甲状腺激素(THs)对脑缺血后SVZ神经再生的影响未见报道。课题组前期研究结果发现,慢性脑缺血大鼠脑组织T3和T4浓度显著下降,外源性补充甲状腺素能显著提高脑组织T3和T4的浓度,明显缩短慢性脑缺血大鼠Morris水迷宫的潜伏期,改善其学习记忆能力；进一步对慢性脑缺血大鼠第7天腹腔注射T3短期干预后,发现侧脑室下区BrdU阳性细胞数显著增加,提示T3可促进SVZ神经祖细胞的增殖,但长期作用对慢性脑缺血大鼠侧脑室下区的神经再生的影响尚不清楚。本课题拟采用成年大鼠双侧颈总动脉永久性结扎术制备慢性脑缺血致血管性认知障碍的动物模型,对慢性脑缺血大鼠设置三碘甲状腺原氨酸(T3)连续7天和14天两个时间点的干预处理,通过腹腔注射BrdU标记增殖细胞,选择内源性细胞标记物DCX,通过BrdU和DCX免疫荧光双重标记侧脑室下区新生的未成熟神经元,同时采用免疫印迹法检测侧脑室下区DCX蛋白的表达水平,观察T3对SVZ神经再生的影响。研究方法1.实验分组：48只雄性SD大鼠随机分为假手术组,2VO组和缺血后三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)干预组,每组8只。2VO组采用双侧颈总动脉永久性结扎术(2VO)制备慢性脑缺血致血管性认知障碍动物模型。假手术组除不结扎双侧颈总动脉外,其余与慢性脑缺血组手术过程相同。缺血后T3干预组于双侧颈总动脉结扎术后次日起给予T3,10ug/30g BodyWeight,1次/天,连续注射7天和14天后,分别处死。假手术组和2VO组大鼠给予腹腔注射生理盐水,剂量同T3干预组,1次/天,连续注射7天和14天后,分别处死。术后各组大鼠连续腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2’-deoxyuridine, BrdU)标记增殖细胞,50mg/kg BodyWeight,2次／天,连续7天。2.各组5只大鼠分别于第7、14天灌注取脑组织,采用BrdU与Doublecortin(DCX)免疫荧光双染法标记新生神经元；3.各组3只大鼠分别于第7、14天取新鲜脑组织冰上分离SVZ,采用免疫印迹法(Western blotting)检测DCX蛋白的表达水平。4.免疫荧光染色计数以一个对实验分组全盲的观察者对SVZ BrdU/DCX阳性细胞的计数结果为主。每组5只大鼠,每只大鼠隔8张切片留取1张进行染色,每只大鼠共计数6张切片的细胞数,细胞计数总数的8倍作为最后细胞数进行统计学分析。实验数据以均数±标准差((?)±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行方差齐性检验及单因素方差(one-way ANOVA)分析,组间多重比较采用LSD法,以P<0.05定义为有统计学差异。研究结果1.免疫荧光双重染色可见缺血7天后,假手术组、2VO组和T3干预组BrdU、DCX阳性细胞都在SVZ表达,沿SVZ分布,三组都可见部分BrdU阳性细胞不表达DCX,部分DCX阳性细胞也不表达BrdU。缺血后T3干预组BrdU和BrdU/DCX阳性细胞与假手术组和2VO组相比,在侧脑室的表达增多。免疫印迹法显示T3给药7天后：与假手术组比较,2VO组、缺血后T3干预组DCX蛋白水平三组间呈递增趋势,缺血后T3干预组增多明显。2.缺血14天后,免疫荧光双重染色显示：T3干预组与假手术组和2VO组相比,缺血后T3干预组BrdU和BrdU/DCX阳性细胞在侧脑室的表达仍增多。2VO14天组BrdU.DCX荧光强度较2VO7天组显著减弱；免疫印迹法显示2VO组DCX蛋白水平降低较明显,缺血后T3干预组DCX蛋白表达仍高于假手术组和2VO组。3.为了进一步量化各组间的差异,我们对免疫荧光染色结果进行了细胞计数统计。结果显示,缺血7天后,T3干预组BrdU阳性细胞较假手术组显著增多(P=0.002),较2VO组增多,但无统计学意义(P=0.084)。缺血14天后,T3干预组与假手术组和2VO14天组相比,BrdU阳性细胞显著增多(P<0.01)。2VO14天组BrdU阳性细胞数降低到2VO7天组的58.2%,两组相比有显著性差异(P=0.013)。缺血后T3干预14天组与缺血后T3干预7天组BrdU阳性细胞数无显著性差异。4.我们对BrdU/DCX双重荧光标记细胞计数的结果显示,假手术组、2VO7天组、缺血后T3干预7天组BrdU/DCX阳性细胞数分别为1502.4±252.6,2636.8±364.6,4316.8±529.9个,组间比较有显著性差异(F=12.60,P=0.001),缺血后T3干预7天组较2VO7天组和假手术组显著增多(P=0.012,P<0.001)。与假手术组和2VO14天组相比,缺血后T3干预14天组BrdU/DCX阳性细胞数显著增多(P<0.001)。2V014天组BrdU/DCX阳性细胞为2V07天组的54.0%,两组相比有显著性差异(P=0.008)。缺血后T3干预14天组与缺血后T3干预7天组BrdU/DCX阳性细胞无显著性差异。研究结论1.在本实验中,缺血7天后,T3干预组SVZ BrdU/DCX阳性细胞数较假手术组和2VO7天组显著增多,虽然脑缺血损伤也能刺激SVZ BrdU阳性细胞和BrdU/DCX阳性细胞的增多,但这种代偿作用与假手术组相比无统计学差异,提示了外源性补充甲状腺激素进一步促进了脑缺血后SVZ新生神经元的增殖。2.缺血14天后,2VO组SVZ BrdU阳性细胞和BrdU/DCX阳性细胞与T3干预14天组和2VO7天组相比明显减少,而缺血后T3干预14天组与缺血后T3干预7天组相比无显著性差异,这一结果说明,慢性脑缺血后给予T3能明显提高BrdU阳性细胞和BrdU/DCX阳性细胞的存活率,增加利用内源性神经祖细胞作为细胞替代治疗的可能性,进一步为脑缺血损伤后功能修复创造机会。