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溶菌酶是人和动物体液和组织中的一种防御因子,是非特异性免疫的重要组成部分,具有抗菌、消炎、促进组织修复和增强免疫力等多种药理作用,因此广泛应用于食品、饲料工业、科研和医学临床中。牛乳溶菌酶(Bos taurus lysozyme 1-LYZ1)作为c型溶菌酶中的一种,在治疗奶牛子宫内膜炎、乳房炎等细菌性疾病中,不仅具有相似的生物学作用,还具有同源性的优势,具有广阔的应用前景。然而由于天然溶菌酶(包括牛乳溶菌酶)的提取步骤繁琐,成本高昂,难以大量的应用于临床。因此,本研究拟通过构建大肠杆菌和毕赤酵母表达系统来制备具有生物活性的重组LYZ1蛋白,以替代天然牛乳溶菌酶,应用于临床实践,研究详情如下:(1)根据GenBank(NM-001077829)发表的牛乳溶菌酶基因核苷酸序列,选择大肠杆菌和酵母偏爱密码子改造并人工合成LYZ1基因,并在基因上、下游分别引入EcoR I与Xho I酶切识别位点,为了便于后期分离纯化,设计时在基因中引入了his-tag。(2)经测序鉴定正确后,将LYZ1基因克隆到表达载体pET-32a上,经PCR、双酶切和测序鉴定后重组表达质粒pET-32a-LYZ1转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得牛乳溶菌酶工程菌株BL21/pET-32a-LYZ1,经IPTG诱导表达了32 Ku大小重组的目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的70%,主要以包涵体形式存在,具有很好的免疫原性,纯化后纯度达95%以上,将其免疫BALB/c小鼠获得牛乳溶菌酶重组蛋白的单因子血清,用于酵母表达重组蛋白的鉴定。(3)在基因LYZ1末端添加XbaⅠ酶切位点后,构建了牛乳溶菌酶的分泌型表达载体pPICZαA-LYZ1,SacⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母菌株GS115,通过Zeocin筛选和PCR鉴定后,获得牛乳溶菌酶工程菌株GS115/ pPICZαA-LYZ1,经甲醇诱导60 h后,进行SDS-PAGE和Western Blotting鉴定表明上清中高效分泌表达了16 Ku大小的重组目的蛋白,具有良好的免疫原性,表达上清经超滤管浓缩后,过his-tag柱纯化,测得上清中重组蛋白浓度为218 mg/L,采用溶壁微球菌法测定上清中溶菌酶活性为2842 U/mL,比活力约为13040.0 U/mg,体外抑菌试验结果表明,重组牛乳溶菌酶对标准葡萄球菌及大肠杆菌菌株具有较好的抗菌作用,而对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌作用较弱。综上所述,本研究成功构建了牛乳溶菌酶的原核表达载体pET-32a-LYZ1和酵母分泌型表达载体pPICZαA-LYZ1,并在受体菌BL21(DE3)和GS115中成功表达,其中酵母上清分泌表达的重组蛋白LYZ1具有抗菌活性,为进一步研究与应用奠定基础。