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目的:树突细胞(dendritic cell,DC)源于造血干细胞,广泛分布淋巴组织和非淋巴组织,是机体内功能最强的抗原呈递细胞(antigenpresenting cell,APS)。DC与其他抗原呈递细胞相比其最大的特点是能显著刺激初始型T细胞增殖。而其他抗原呈递细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞,因此DC是机体免疫反应的始动者,在免疫反应应答中具有独特的地位。目前认为具有典型的树突状形态,膜表面高表达主要组织相容性复合体-Ⅱ(maior histocompability complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)类分子,能移行至淋巴器官和刺激初始型T细胞增殖活化,并且具有一些相对特异的表面标志的一类细胞方能称之为DC。所以要鉴定是否是DC往往通过形态学,组合型表面标志和刺激初始型T细胞增殖能力三个方面加以综合判断。本文系以8～10周龄近交系SD和Wistar大鼠为研究对象,应用大鼠骨髓来源DC的体外诱导与扩增,以光镜、扫描电镜观察DC的形态学检测细胞形态变化以及DC表型分析来研究大鼠骨髓来源树突细胞的体外培养及功能测定。
方法:(1)选择8～10周龄近交系SD和Wistar大鼠(体重180～200g)作为实验对象。获取大鼠骨髓来源DC,并分为实验组和对照组,实验组DC培养基中含有Rgm-CSF和Ril-4,对照组培养基中不含有Rgm-CSF和Ril-4,培养基其余成分及培养方法相同,进行体外诱导与扩增。培养期间隔日半量换液1次,并于倒置相差显微镜下观察细胞生长状况和形态,分别培养13天后收获悬浮细胞。(2)观察DC形态学:①光镜观察:培养期间每天用倒置显微镜观察细胞形态变化。②扫描电镜观察(培养13天的实验组DC用扫描电镜进行观察)。(3)流式细胞仪检测细胞表面表型。用相同荧光素直接标记的同分异构抗体代替标记抗体作对照。(4)制备淋巴细胞悬液并进行细胞分离,将其分别与实验组和对照组DC细胞按不同比例混合,孵育培养后测492nm吸光度(A)值。(5)所有数据以SPSS16.0软件包进行处理,两组间比较采用t检验,P＜0.05为有统计学意义。
结果:①光镜观察:培养13天后,对照组大鼠骨髓细胞呈类圆形,分散生长。实验组大部分细胞呈悬浮状态,细胞有明显毛刺。②扫描电镜观察:培养13天后,实验组的细胞表面有大量树突状突起,比较粗糙,某些突起形成薄片样结构,符合典型的DC形态特征。③大鼠DC特异性表面分子OX-62的表达:其中对照组DC的OX-62表达量为40.79±1.49％,实验组DC的OX-62表达量为41.44±1.92％,两组差异无统计学意义(P＞0.05)。④共刺激分子表达:对照组DC前体共刺激分子CD80、CD86阳性表达率分别为14.39±0.98％和17.38±1.11％,而实验组DC共刺激分子CD80、CD86阳性表达率分别为85.06±2.98％和83.83±3.19％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。⑤DC对同种T细胞的促增殖能力:MLR结果显示对照组DC前体不能有效刺激同种T细胞增殖,而实验组DC具有较强的体外刺激T淋巴细胞增殖的能力,随着DC数量的增加,T细胞的增殖效应加强,差异有统计学意义(P＜0.01)。本实验中,我们将贴壁时间缩短至3小时,改变了以往为去除粒细胞和淋巴细胞将大鼠骨髓细胞贴壁培养4-6天后悬浮细胞,培养的DC43％表达OX-62,与此前相关报道的数据不同。
结论:本实验结果表明,加入Rgm-CSF和Ril-4的培养基可以诱导骨髓前体细胞分化发育为成熟DC。成熟DC具有较强的体外刺激T淋巴细胞增殖的能力。实验组的DC前体细胞经过13天的培养,在缩短时间后贴壁细胞群中可以诱导出大量的OX62+DC。