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第一部分LEE011抗宫颈癌细胞活性研究
目的：检测LEE011抗宫颈癌细胞活性，包括对宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞增殖能力、以及诱导细胞凋亡能力的影响。
方法：细胞形态学观察法观测不同浓度LEE011处理48h后宫颈癌细胞系C33A及HeLa的形态学改变；流式细胞术检测LEE011(10μM)处理48h后宫颈癌细胞系C33A及HeLa的细胞周期及细胞凋亡水平的变化。
结果：LEE011处理48h后，随着浓度的提高，宫颈癌细胞系C33A的细胞非正常形态(细胞变形、变圆、细胞溶解、细胞变少等)增多；HeLa的细胞形态和数量无明显变化。流式细胞术结果显示LEE011(10μM)处理48h后宫颈癌细胞系C33A，细胞周期阻滞在G1期的细胞数增多，S期及G2/M期细胞数减少，具有统计学差异(P＜0.05)；而HeLa的处理组与对照组的细胞周期无明显差异。流式细胞术结果显示LEE011(10μM)处理48h后宫颈癌细胞系C33A，与对照组相比，实验组的凋亡率增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而Hea的处理组与对照组的细胞凋亡率无明显差异。
结论：LEE011抑制宫颈癌细胞系C33A的细胞增殖能力、阻滞细胞周期进程并诱导C33A细胞发生凋亡，而对宫颈癌细胞系HeLa无明显抗肿瘤活性。
第二部分LEE011抗宫颈癌细胞活性的机制研究
目的：探索LEE011抗宫颈癌细胞活性的分子机制及其与Rb-E2F信号通路的关系。检测宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中CDK4、CDK6和cyclinD1的本底表达量，以明确LEE011作用于相关信号通路的可行性；检测Rb-E2F信号通路上游通路相关蛋白CDK4、CDK6和cyclinD1及CDK2和cyclinE1的表达量，以明确LEE011抑制细胞增殖过程中细胞周期调控相关通路信号分子的改变；检测凋亡通路中相关蛋白的表达量，以明确LEE011诱导细胞凋亡过程中凋亡通路相关信号分子的改变。
方法：细胞免疫荧光技术和westernblotting技术来检测宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中CDK4、CDK6和cyclinD1的本底表达量；Westernblotting技术检测不同浓度LEE011(0，5，10，15，20μM)处理48h后的宫颈癌细胞里相关通路分子蛋白表达水平的变化。
结果：通过细胞免疫荧光技术和westernblotting技术检测发现，宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中存在高水平表达的CDK4、CDK6和cyclinD1，且主要定位细胞核内。通过westernblotting技术检测不同浓度LEE011(0，5，10，15，20μM)处理48h后的宫颈癌细胞里相关通路分子蛋白表达水平，发现CDK4、CDK6、E2F1、P-Rb、P16、cyclinE1、CDK2等周期相关蛋白存在剂量依赖性的表达量下调；凋亡蛋白也存在剂量依赖性现象，Bax蛋白表达量升高，Bcl-2蛋白表达量下调。但是LEE011处理的HeLa细胞中细胞周期调控相关通路及凋亡通路信号分子无明显改变。
结论：LEE011可能通过Rb-E2F信号通路来阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡，从而发挥抗宫颈癌C33A细胞活性；然而该通路在宫颈癌HeLa细胞中无明显改变，有待进一步研究。
第三部分LEE011在裸鼠移植瘤模型中抗宫颈癌活性研究
目的：在裸鼠移植瘤模型中验证LEE011的抗宫颈癌活性及其作用机制，并评估LEE011在体内的药物安全性与毒性反应。
方法：裸鼠腋下种植宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞，建立宫颈癌细胞裸鼠移植瘤模型。设置LEE011处理组及对照组，每组5只；其中LEE011处理组裸鼠除正常饮食外经灌胃给予LEE011(200mg／kg／day)，对照组裸鼠除正常饮食外给予等量溶剂(0.5%甲基纤维素)处理。每3天监测荷瘤裸鼠的体重、肿瘤体积变化及生存情况，总计21天；通过免疫组化方法检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb、Ki-67蛋白的表达水平；通过TUNEL法检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平变化；通过眼球取血法，血液生化分析荷瘤裸鼠的生化指标ALT、AST、ALB、ALP、BUN、CR、LDH-L及CK的水平变化；通过HE染色法观察荷瘤裸鼠的心肌组织、肝组织及肾组织的形态学变化。
结果：在C33A裸鼠移植瘤模型中，LEE011处理组移植瘤体积及重量明显小于对照组，且LEE011处理组移植瘤生长速度显著慢于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，LEE011处理组的荷瘤裸鼠的体重与对照组无明显差异；免疫组化结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb、Ki-67蛋白的表达水平比对照组的更低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；TUNEL法结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；血液生化分析显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的生化指标无明显改变；HE染色法观察显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的心肌组织、肝组织及肾组织的形态学无明显改变。在HeLa裸鼠移植瘤模型中，LEE011处理组移植瘤体积及重量与对照组无明显差异，LEE011处理组的荷瘤裸鼠的体重与对照组相比下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)；免疫组化结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中CDK6、cyclinD1、Rb、Ki-67蛋白的表达水平与对照组相比无明显差异；TUNEL法结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平与对照组相比无明显差异；血液生化分析显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的生化指标无明显改变；HE染色法观察显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的心肌组织、肝组织及肾组织的形态学无明显改变。
结论：LEE011在宫颈癌细胞系C33A裸鼠移植瘤模型体内具有抗宫颈癌活性，其作用机制与CDK4/6-cyclinD-Rb-E2F信号通路有关；LEE011在宫颈癌细胞系HeLa裸鼠移植瘤模型体内不具有明显抗宫颈癌活性，可能与两株细胞系遗传学背景，药物剂量等因素相关，有待进一步研究。LEE011在宫颈癌裸鼠移植瘤模型体内无明显毒性反应，较为安全。
第四部分生物信息学分析CDK4/6-cyclinD-Rb-E2F在宫颈癌不同亚型组织中的表达
目的：为了探究LEE011在宫颈癌细胞C33A与HeLa的体外和体内抗肿瘤活性差异的原因，针对LEE011主要靶点和作用的主要信号通路，分析相关通路蛋白在宫颈癌不同亚型组织中的表达量，以筛选或排除可能因素，为后续筛选生物标记物等临床试验及应用研究做好基础准备。
方法：从TCGA数据库中下载宫颈癌患者的RNA二代测序数据和相应的临床特征信息。根据HPV感染状态，分为HPV阳性和HPV阴性两种亚型。比较CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb1、E2F1、Bax及Bcl-2基因的RNA水平，用R包DEseq筛选两种亚型之间相关通路基因有无统计学差异。
结果：分析了TCGA数据库中宫颈癌患者肿瘤样本信息178例，其中169例是HPV感染阳性，9例是HPV感染阴性。用Deseq比较CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb1、E2F1、Bax及Bcl-2基因在两组宫颈癌亚型的RNA水平，按照|log2FC|＞1且P＜0.05的原则发现差异均不显著。
结论：不同亚型宫颈癌病人的肿瘤组织中CDK4/6-cyclinD-Rb-E2F信号通路的相关分子表达量高低可能与LEE011药物敏感性无明显关系，有待进一步研究筛选生物标记物及分析药物敏感性差异的原因。
目的：检测LEE011抗宫颈癌细胞活性，包括对宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞增殖能力、以及诱导细胞凋亡能力的影响。
方法：细胞形态学观察法观测不同浓度LEE011处理48h后宫颈癌细胞系C33A及HeLa的形态学改变；流式细胞术检测LEE011(10μM)处理48h后宫颈癌细胞系C33A及HeLa的细胞周期及细胞凋亡水平的变化。
结果：LEE011处理48h后，随着浓度的提高，宫颈癌细胞系C33A的细胞非正常形态(细胞变形、变圆、细胞溶解、细胞变少等)增多；HeLa的细胞形态和数量无明显变化。流式细胞术结果显示LEE011(10μM)处理48h后宫颈癌细胞系C33A，细胞周期阻滞在G1期的细胞数增多，S期及G2/M期细胞数减少，具有统计学差异(P＜0.05)；而HeLa的处理组与对照组的细胞周期无明显差异。流式细胞术结果显示LEE011(10μM)处理48h后宫颈癌细胞系C33A，与对照组相比，实验组的凋亡率增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而Hea的处理组与对照组的细胞凋亡率无明显差异。
结论：LEE011抑制宫颈癌细胞系C33A的细胞增殖能力、阻滞细胞周期进程并诱导C33A细胞发生凋亡，而对宫颈癌细胞系HeLa无明显抗肿瘤活性。
第二部分LEE011抗宫颈癌细胞活性的机制研究
目的：探索LEE011抗宫颈癌细胞活性的分子机制及其与Rb-E2F信号通路的关系。检测宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中CDK4、CDK6和cyclinD1的本底表达量，以明确LEE011作用于相关信号通路的可行性；检测Rb-E2F信号通路上游通路相关蛋白CDK4、CDK6和cyclinD1及CDK2和cyclinE1的表达量，以明确LEE011抑制细胞增殖过程中细胞周期调控相关通路信号分子的改变；检测凋亡通路中相关蛋白的表达量，以明确LEE011诱导细胞凋亡过程中凋亡通路相关信号分子的改变。
方法：细胞免疫荧光技术和westernblotting技术来检测宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中CDK4、CDK6和cyclinD1的本底表达量；Westernblotting技术检测不同浓度LEE011(0，5，10，15，20μM)处理48h后的宫颈癌细胞里相关通路分子蛋白表达水平的变化。
结果：通过细胞免疫荧光技术和westernblotting技术检测发现，宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞中存在高水平表达的CDK4、CDK6和cyclinD1，且主要定位细胞核内。通过westernblotting技术检测不同浓度LEE011(0，5，10，15，20μM)处理48h后的宫颈癌细胞里相关通路分子蛋白表达水平，发现CDK4、CDK6、E2F1、P-Rb、P16、cyclinE1、CDK2等周期相关蛋白存在剂量依赖性的表达量下调；凋亡蛋白也存在剂量依赖性现象，Bax蛋白表达量升高，Bcl-2蛋白表达量下调。但是LEE011处理的HeLa细胞中细胞周期调控相关通路及凋亡通路信号分子无明显改变。
结论：LEE011可能通过Rb-E2F信号通路来阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡，从而发挥抗宫颈癌C33A细胞活性；然而该通路在宫颈癌HeLa细胞中无明显改变，有待进一步研究。
第三部分LEE011在裸鼠移植瘤模型中抗宫颈癌活性研究
目的：在裸鼠移植瘤模型中验证LEE011的抗宫颈癌活性及其作用机制，并评估LEE011在体内的药物安全性与毒性反应。
方法：裸鼠腋下种植宫颈癌细胞系C33A和HeLa细胞，建立宫颈癌细胞裸鼠移植瘤模型。设置LEE011处理组及对照组，每组5只；其中LEE011处理组裸鼠除正常饮食外经灌胃给予LEE011(200mg／kg／day)，对照组裸鼠除正常饮食外给予等量溶剂(0.5%甲基纤维素)处理。每3天监测荷瘤裸鼠的体重、肿瘤体积变化及生存情况，总计21天；通过免疫组化方法检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb、Ki-67蛋白的表达水平；通过TUNEL法检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平变化；通过眼球取血法，血液生化分析荷瘤裸鼠的生化指标ALT、AST、ALB、ALP、BUN、CR、LDH-L及CK的水平变化；通过HE染色法观察荷瘤裸鼠的心肌组织、肝组织及肾组织的形态学变化。
结果：在C33A裸鼠移植瘤模型中，LEE011处理组移植瘤体积及重量明显小于对照组，且LEE011处理组移植瘤生长速度显著慢于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，LEE011处理组的荷瘤裸鼠的体重与对照组无明显差异；免疫组化结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb、Ki-67蛋白的表达水平比对照组的更低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；TUNEL法结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；血液生化分析显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的生化指标无明显改变；HE染色法观察显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的心肌组织、肝组织及肾组织的形态学无明显改变。在HeLa裸鼠移植瘤模型中，LEE011处理组移植瘤体积及重量与对照组无明显差异，LEE011处理组的荷瘤裸鼠的体重与对照组相比下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)；免疫组化结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中CDK6、cyclinD1、Rb、Ki-67蛋白的表达水平与对照组相比无明显差异；TUNEL法结果显示LEE011处理组裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平与对照组相比无明显差异；血液生化分析显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的生化指标无明显改变；HE染色法观察显示所用剂量下的LEE011对荷瘤裸鼠的心肌组织、肝组织及肾组织的形态学无明显改变。
结论：LEE011在宫颈癌细胞系C33A裸鼠移植瘤模型体内具有抗宫颈癌活性，其作用机制与CDK4/6-cyclinD-Rb-E2F信号通路有关；LEE011在宫颈癌细胞系HeLa裸鼠移植瘤模型体内不具有明显抗宫颈癌活性，可能与两株细胞系遗传学背景，药物剂量等因素相关，有待进一步研究。LEE011在宫颈癌裸鼠移植瘤模型体内无明显毒性反应，较为安全。
第四部分生物信息学分析CDK4/6-cyclinD-Rb-E2F在宫颈癌不同亚型组织中的表达
目的：为了探究LEE011在宫颈癌细胞C33A与HeLa的体外和体内抗肿瘤活性差异的原因，针对LEE011主要靶点和作用的主要信号通路，分析相关通路蛋白在宫颈癌不同亚型组织中的表达量，以筛选或排除可能因素，为后续筛选生物标记物等临床试验及应用研究做好基础准备。
方法：从TCGA数据库中下载宫颈癌患者的RNA二代测序数据和相应的临床特征信息。根据HPV感染状态，分为HPV阳性和HPV阴性两种亚型。比较CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb1、E2F1、Bax及Bcl-2基因的RNA水平，用R包DEseq筛选两种亚型之间相关通路基因有无统计学差异。
结果：分析了TCGA数据库中宫颈癌患者肿瘤样本信息178例，其中169例是HPV感染阳性，9例是HPV感染阴性。用Deseq比较CDK4、CDK6、cyclinD1、Rb1、E2F1、Bax及Bcl-2基因在两组宫颈癌亚型的RNA水平，按照|log2FC|＞1且P＜0.05的原则发现差异均不显著。
结论：不同亚型宫颈癌病人的肿瘤组织中CDK4/6-cyclinD-Rb-E2F信号通路的相关分子表达量高低可能与LEE011药物敏感性无明显关系，有待进一步研究筛选生物标记物及分析药物敏感性差异的原因。