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帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的发病机制至今尚不明确,其特征性的病理改变是黑质细胞脱失,残存的黑质细胞胞浆内出现 Lewy 小体。Lewy 小体形成可能与黑质细胞蛋白酶体(proteasome)功能下降,削弱了对 α-synuclein 等不必要蛋白的降解与清除有关。大量的流行病学调查显示除草剂百草枯(paraquat,PQ)的长期暴露,可使患 PD 的风险明显增加。目前关于百草枯的暴露能否增加蛋白酶体功能轻微损害的大鼠患 PD 的风险缺乏研究。体外研究发现,骨髓基质细胞( marrow stromal cells, MSCs)能不断分泌脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF),BDNF 对多巴胺能神经元具有特殊的保护作用。然而,关于植入 PD 大鼠脑内 MSCs 能否通过分泌 BDNF 而起神经保护作用的研究还未见报道。本研究的目的:1、利用蛋白酶体选择性抑制剂lactacystin,抑制黑质细胞蛋白酶体功能,建立伴 Lewy 小体的偏侧 lactacystin-PD动物模型,探讨蛋白酶体功能削弱在 PD 发病中的作用;2、研究小剂量的 PQ 与lactacystin 之间有无协同毒性作用以及对增加患 PD 风险的影响;3、研究 MSCs对 lactacystin-PD 大鼠的神经保护作用。 第一部分 伴 Lewy 小体的偏侧 lactacystin-PD 动物模型的建立 将 70 只 SD 大鼠随机分为 NS 组、6-OHDA 组和 lactacystin 组(设 0.2μg、2μg 和 8μg 3 组剂量,以下简称 0.2μg 组、2μg 组和 8μg 组),每组 14 只,分别向各组大鼠立体定向注射 NS、6-OHDA16μg 和 lactacystin 0.2μg、2μg、8μg。观察大鼠自主行为和阿朴吗啡(apomorphine,APO)诱导的旋转行为;应用 HE 染色和透射电镜观察黑质变性、Lewy 小体形态及其超微结构;应用免疫组化观察黑质细胞 α-synuclein 和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达;采用RT-PCR 方法测定黑质细胞 TH mRNA 的表达;利用 HPLC 测定纹状体区多巴胺(dopamine,DA)和高香草酸(homovanillic acid,HVA)含量。结果显示:NS组未见行为异常;6-OHDA 组大鼠出现明显的运动迟缓、少动;实验组随着lactacystin 剂量的增加,行动迟缓、少动等 PD 样症状逐渐加重,8μg 组出现与6-OHDA 组类似的 APO 诱导的向健侧旋转运动;病理检查发现 6-OHDA 组黑质细胞较 NS 组显著减少,但未有 Lewy 小体出现;实验组随着 lactacystin 剂量的增加黑质细胞数逐渐减少,8μg 组出现数量较多的、α-synuclein 免疫反应呈强阳 5<WP=6>博士研究生毕业论文性的 Lewy 小体;2μg 组和 8μg 组 TH 蛋白和 mRNA 的表达分别较对照组少 63.34%(P<0.001)、60.55%(P<0.05)和 81.95%(P<0.001)、89.53%(P<0.01);纹状体区 DA、HVA 的含量也相应减少;8μg 组的减少量与 6-OHDA 组相近。 第二部分 百草枯与 lactacystin 对黑质纹状体系统的协同毒性作用 取 SD 雄性大鼠 56 只,随机分为 NS 组、lactacystin 组(以下简称 lact 组)、PQ 组和双因素组,每组 14 只。PQ 组和双因素组预先每日口服小剂量百草枯0.5mg/kg,NS 组和 lact 组每日口服等量的生理盐水,连续喂养 8 周后,在 lact组和双因素组大鼠单侧 SNc 立体定向注射低剂量蛋白酶体抑制剂 lactacystin2μg,NS 组和 PQ 组注射等量的生理盐水。观察大鼠行为变化、TH 阳性细胞数、α-synuclein 表达以及纹状体区 DA 和 HVA 含量的变化。结果显示:仅双因素组大鼠出现严重的动作迟缓、少动、姿势异常以及 APO 诱导的持续左向旋转;黑质部 TH 阳性细胞数和纹状体区 DA 和 HVA 的含量较 NS 组显著减少,且大于lact 组和 PQ 组两组大鼠减少之和(P<0.05);双因素组大鼠黑质细胞 α-synuclein的表达较NS组显著增高,多数细胞内出现α-synuclein免疫反应呈强阳性的Lewy小体。 第三部分 骨髓基质细胞对 lactacystin-PD 大鼠神经保护作用 在大鼠单侧黑质致密部(SNc)立体定向注射蛋白酶体抑制剂 lactacystin 8μg,建立表达 Lewy 小体并向偏侧旋转的 PD 大鼠模型。取成年雄性 SD 大鼠骨髓,培养、分离、增值和纯化 MSCs。培养至 4-6 代进行细胞移植。实验组采用立体定向技术向纹状体区注射 4×105个标有 Brdu 的 MSCs,对照组注射等量的生理盐水。观察移植前后大鼠的旋转行为变化以及 MSCs 在脑内的 BDNF 表达、迁移及分化情况。结果显示:多数接受 MSCs 移植的 PD 大鼠 APO 诱导的旋转行为较移植前明显改善。MSCs 在大鼠脑内可以广泛迁移,分布于纹状体、胼胝体和皮质等部位,并大量表达脑源性神经营养因子 BDNF;部分 MSCs 分化为神经干细胞样和神经元样细胞,但未能分化为 DA 能样神经细胞。 结论1. 蛋白酶体功能障碍所引起的 α-synuclein 降解受阻,是 Lewy 小体形成、黑质 变性最终导致 PD 的一个重要因素。2. lactacystin 诱导的 α-synuclein 异常聚集显著抑制黑质细胞 TH mRNA 及蛋白 6