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RNAi技术已经成为基因功能筛选、生物医药研究等方面不可缺失的工具。传统的RNAi筛选依赖于多孔板,当进行大规模筛选时,需要精密的高通量仪器以及成本昂贵的耗材。为了解决这些问题,本实验室在前期工作中开发了一种新型的高通量筛选技术——自组装细胞芯片技术(SAMCell芯片)。该技术具有以下优点:1)由于所有的细胞都处于同一个培养皿中,实验结果可信度高、噪音干扰低;2)微细加工技术可以将偏差控制在万分之一以下,实验准确度高;3)所有的细胞都处于同一张芯片上,后期处理不依赖于高通量仪器,而且处理方便、成本低。 为了进一步地完善该技术,并拓展其应用范围,本论文在芯片的性能、兼容性等方面做了一系列工作:首先,我们系统评估了储存时间、转染试剂等参数对芯片的影响,研究表明芯片可以在4℃保存至少6个月;其次,我们经过实验表明除了siRNA外,多种物质如质粒、蛋白质(转化生长因子,表皮生长因子)、化学物质(G418)等均能与SAMcell芯片兼容使用。 miRNA靶基因的寻找一直以来都是生物学家们亟待解决的一个难题,本研究中我们结合SAMcell进行miRNA靶基因的筛选工作。miRNA对它的靶基因的抑制能力相对siRNA较弱,一般只有20%~80%的抑制效果,报告基因的表达量水平差异较小,为了解决这一问题,我们用Gal4-VP的放大体系将整个报告基因的表达量放大至少1000倍,再结合SAMcell芯片技术进行筛选工作,取得了很好的实验结果。 RNAi技术目前被广泛而高效地应用于下调基因使其失去功能(Loss-of-function)的研究工作,并且已经应用于大规模的筛选工作中。TALE-VP技术是最新兴起的一项技术,它可以过表达(gain-of-function)基因,我们尝试将TALE-VP技术、RNAi技术与SAMcell芯片技术结合起来进行筛选工作,发现TALE-VP技术的加入可以很好地弥补现有缺失筛选方法的不足。 我们选取了一类十分重要的基因——激酶基因进行大规模筛选工作。激酶基因被证明在生物体内起着调控各种关键性的蛋白的作用。在经过针对细胞凋亡的筛选工作中,我们从随机挑选出来的激酶库中筛选出大约7%的基因被抑制之后会促进细胞凋亡。进一步用TALE-VP实验证实之后,发现了两个十分重要的基因,它们的过量表达可以阻止细胞进入凋亡程序,说明这两个基因在细胞凋亡通路中起着十分重要的作用。继而我们针对细胞迁移进行大规模筛选工作,从筛选结果上看大约有37%的基因正调控细胞迁移,约35%的基因负调控细胞迁移,而剩下的大约28%的基因的表达水平不影响细胞迁移。而进一步细胞入侵实验表明对细胞迁移有影响的基因中大部分对细胞入侵有着相同的作用效果。众所周知细胞迁移和细胞入侵一直以来都是治疗癌症的障碍,我们在高通量筛选中得到的结果能够为癌症细胞扩散的控制提供极为有用的信息。 以上研究结果证明SAMcell芯片技术在高通量筛选、药物研发等方面具有巨大的应用前景。