Myostatin(MSTN,肌肉生长因子),又名GDF8 ,属于转化生长因子β( TGFβ)家族成员。哺乳类中在主要在发育的和成年个体的骨骼肌中表达,起着抑制肌肉生长的作用。Myostatin缺失突变纯合小鼠单块肌肉的重量约为野生小鼠的2～3倍;具有增加的骨骼肌质量的牛品系——“双肌牛”,如比利时蓝牛和皮德蒙特牛——即是这一基因自然突变的结果。正是由于MSTN基因对肌肉生长的控制,使其在水产领域具有潜在的应用价值。基于这一原因,我们从几种重要的鲽形目养殖鱼类入手,分离并克隆了这些鱼的MSTN基因,并对其进行了序列分析和表达研究,同时我们还对牙鲆胚胎发育过程中内参基因的表达变化进行了研究,筛选出了适合鱼类胚胎发育过程中基因表达研究的合适内参。得到以下结果:实验采用同源克隆和锚定PCR的方法,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉中获得了长为5538 bp的牙鲆MSTN基因组序列。该序列包含3个外显子,2个内含子。其中内含子1长362bp,内含子2长762bp,拼接后的外显子总共长1134bp,编码378个氨基酸,其中含有9个保守的半胱氨基酸残基和一个保守的蛋白酶加工位点RVRR。在MSTN基因的5’上游序列中包含有一个潜在的TATA盒和12个E-box位点。同时序列分析表明牙鲆MSTN的5’-UTR、内含子2和3’UTR都存在微卫星序列。RT-PCR结果显示,MSTN在肌肉、眼、脑、卵巢、肾脏、鳃弓软骨、心脏、肝脏、脾脏、鳃丝、肠、精巢和血液中都有表达,但表达量明显不同。我们还发现MSTN在脑中的表达也存在着明显的差异。定量PCR分析暗示牙鲆MSTN的表达受发育的调节,不同发育时期表达量的变化明显不同。并且在未受精的卵细胞中也检测到了牙鲆MSTN的mRNA,暗示这可能是母体mRNA的存留。为筛选出了适合鱼类胚胎发育过程中基因表达研究的合适内参,我们对牙鲆胚胎发育过程中看家基因的表达变化进行了研究。结果表明多数常用的mRNA基因并不适合用于整个胚胎期间基因表达的校正,它们在胚胎发育的过程中表达变化明显。尽管如此,某些基因在牙鲆胚胎发育过程中依旧存在阶段性稳定表达。在整个胚胎发育阶段表达最稳定的是18S rRNA基因,因而可以将其用作整个胚胎期间基因表达分析的内参基因。对牙鲆30个个体的开放阅读框60个阳性克隆进行了测序,鉴定了19个单核苷酸多态位点(SNPs)。其中11个导致了氨基酸序列的变化,8个为中性突变,并不改变氨基酸的序列。根据内含子2和3’-UTR中的微卫星位点设计引物对存在于养殖群体中的生长速率不同的两类个体进行的检测并未扩增出大小个体所特有的条带,暗示着这两个微卫星位点很可能与生长速率并无直接的关系。对牙鲆腹腔注射灭活鳗弧菌,观测MSTN在肌肉、肝脏、肾脏中的表达。结果显示,灭活鳗弧菌的刺激并未对三种组织中MSTN的表达量造成显著性的改变(P>0.1)。然而在整个刺激期间,肝脏和肾脏中却观察到了比注射生理盐水的对照略高的表达,尽管在统计学上不显著。推测可能高剂量的灭菌鳗弧菌对肝脏和肾脏造成了轻微的损伤,使MSTN的表达量略微升高,就如同在哺乳动物心肌梗死的病灶区域观测到MSTN升高的表达一样。采用同源克隆的方法,从半滑舌鳎、大菱鲆、石鲽的肌肉中获得了三种鱼的全长MSTN cDNA序列。舌鳎MSTN cDNA序列全长1584bp,包括49 bp的5’UTR, 3’UTR长401 bp以及1134 bp的ORF,编码377个氨基酸。大菱鲆MSTN cDNA序列全长2559bp,包括48 bp的5’UTR,3’UTR长1380 bp以及1131 bp的ORF,编码376个氨基酸。石鲽MSTN cDNA序列全长2457bp,包括50 bp的5’UTR, 3’UTR长1273 bp以及1134 bp的ORF,编码377个氨基酸。所有三种鱼的MSTN cDNA的3’UTR区都含有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA。使用基因特意性引物扩增三种鱼的基因组DNA,分别得到了三种鱼的内含子序列,石鲽MSTN的两个内含子intronI、intronII,大小分别为348 bp、703 bp,大菱鲆MSTN的两个内含子大小分别为254 bp、845 bp,半滑舌鳎MSTN的两个内含子分别为740 bp、403 bp。尽管MSTN的内含子在这三种鱼中有较大的差别但都显示了保守的内含子-外显子边界,符合GT-AG规则。分析这些MSTN的内含子和3’非编码区发现,这些区域存有微卫星重复。组织分布研究揭示了半滑舌鳎MSTN表达的广谱性,差异性。尽管MSTN在肌肉、脑、卵巢、肾脏、心脏、肝脏、脾脏、鳃丝、肠和精巢中都有表达,但只有肌肉高量表达MSTN基因,而在其余组织中表达量都相对较低。构建了pGex-4T-3-His载体,并将牙鲆MSTN基因的前肽和成熟体基因序列插入其中构建了表达GST和6×His双标签的重组表达子,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,使用His-bind预装柱纯化了重组的前肽和成熟肽蛋白。通过梯度透析成功的获得了可溶的GST-前肽重组蛋白,为进一步的研究奠定了基础。