研究背景先天性小耳畸形是胚胎发育过程中第一、二鳃弓发育异常而引起的一组以耳廓形态异常、外耳道狭窄或闭锁、中耳发育不良以及传导性听力障碍为主要特征的先天性发育畸形。先天性小耳畸形的发病率因不同种族、不同地区而异。我国的新生儿流行病学调查显示小耳畸形发病率约为3.06/万。研究报道,小耳畸形的发病率呈现出逐年增高的趋势。耳廓的残缺可能会导致小耳畸形患者在成长过程中产生自卑心理,外耳和中耳畸形导致的传导性听力障碍对于小耳畸形患者的语言发育亦有一定的影响,加之耳廓修复或再造手术的复杂性以及相应费用等都给患者及其家庭带来了沉重的心理及经济负担。因此,明确小耳畸形病因及发病机制,降低发病率具有重要意义。目前先天性小耳畸形的发病原因尚不十分明确,既往研究报道环境因素与其发病有很强的相关性。孕期营养物质缺乏、接触药物、母体病毒感染或患有某些慢性病等都是小耳畸形发病的危险因素。家族遗传倾向也是小耳畸形发病的重要因素。基因组特定区域拷贝数变异或基因位点变异等都是小耳畸形病因学研究的重点。全外显子组测序技术将关注点聚焦于可转录翻译为蛋白质并行使特定生物学功能的外显子区域,具有效率高、准确度高及费用低等多种优点,目前已经被大规模应用于遗传性疾病的研究。本研究以一个呈常染色体显性遗传的先天性小耳畸形家系为研究对象,以全外显子组测序技术为手段来探索家系可疑致病基因。并进一步验证该基因突变后对蛋白结构及功能的影响来分析其导致小耳畸形发病的可能机制。希望此研究能够为未来探索该基因突变与小耳畸形发生发展的确切机制提供基础,并为进行小耳畸形遗传病因学研究提供新的思路。方法1、收集一个三代小耳畸形家系先证者及其部分家系成员的临床基本信息、影像学资料以及肘静脉血液样本进行DNA提取后送全外显子组测序。通过对测序结果进行生物信息学分析,初步筛选到细胞色素P450家族26亚家族A成员1（Cytochrome P450 Family 26 Subfamily A Member 1,CYP26A1）为可疑致病基因,并进一步在散发小耳畸形患者中进行该基因的验证。2、通过在多物种间进行氨基酸序列对比来对位点进化保守性进行检测;对野生型和突变型蛋白质三维结构进行计算机模拟,以评估并分析突变位点对编码蛋白结构的影响;绘制编码蛋白二级结构示意图,探索突变位点在细胞色素P450结构域中的位置。3、构建携带野生型及突变型CYP26A1基因的质粒,并以空白载体作为对照组,转染细胞后观测蛋白细胞内定位的情况。并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR,qPCR）和蛋白质印迹实验（Western Blot）来检测野生型及突变型质粒在mRNA表达水平及蛋白表达水平的差异。结果1、通过对先证者以及部分家系成员的外周血DNA样本进行全外显子组测序以及对测序结果进行生物信息学分析,初步锁定了CYP26A1基因的7号外显子上的 单 核 苷 酸 无 义 突 变（NM000783:exon7:c.C1252T:p.R418X,NM057157:exon7:c.C1045T:p.R349X）,可能为该小耳畸形家系的致病突变。此位点在家系所有患者中均携带,同时不存在于未患病成员中。20名散发小耳畸形患者的测序结果显示其中一名患者携带有CYP26A1基因的2号外显子上的单核苷酸错义突变（NM000783:exon2:c.G276C:p.M92I,NM057157:exon2:c.G69C:p.M23I）。以上位点在三个基因频率数据库中都未曾被报道过,且预测软件分析位点基因突变的效应结果为有害突变。2、物种间进化保守性检测分析显示该家系突变氨基酸序列位点在多个物种间高度保守。且在无义突变导致蛋白缺失的另外79个氨基酸中,大多数都具有高度的序列保守性。野生型和突变型蛋白质三维结构计算机模拟结果显示蛋白截断后长度明显缩短,蛋白整体结构,尤其是末端结构发生明显改变。分析CYP26A1基因及蛋白产物序列,结果显示突变位点及后续缺失位点中的70个氨基酸序列都位于细胞色素P450的保守结构域中。3、将携带野生型及突变型CYP26A1基因的质粒转染细胞后进行倒置荧光显微镜观察、qPCR和Western Blot实验后发现相较于野生型蛋白,突变蛋白的细胞内定位明显不同,在细胞中的mRNA表达水平及蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义。结论综合以上研究,我们通过全外显子组测序技术在一先天性小耳畸形家系中筛选出CYP26A1基因的罕见无义突变,可能为该家系的致病基因。一系列的生物信息学分析及实验结果显示CYP26A1基因突变后影响蛋白的结构、定位以及mRNA和蛋白质的表达水平,从而可能会在胚胎发育过程中通过影响维甲酸的浓度梯度分布进而导致小耳畸形的发生。