miR-150-5p调控BMSCs成骨分化在老年性骨质疏松发生中的作用研究

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目的:研究骨质疏松老年人与正常骨质老年人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化能力是否存在显著差异;从基因水平,研究骨质疏松老年人与正常骨质老年人BMSCs中的miR-150-5p与IGF2BP1(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1)表达水平是否存在显著差异;研究miR-150-5p对老年人BMSCs成骨分化的作用;研究IGF2BP1对老年人BMSCs成骨分化的作用;研究miR-150-5p是否通过靶向抑制IGF2BP1进而发挥负调控老年人BMSCs成骨分化的作用。方法:第一步:分离提取、纯化骨质疏松老年人与正常骨质老年人的BMSCs并分组,即实验组:骨质疏松老年组BMSCs;对照组:正常骨质老年组BMSCs。从细胞形态学、间充质干细胞标志物及诱导成骨分化能力等方面对两组BMSCs进行鉴定及对比。第二步:从成骨基因表达水平(Runx2、Col1a1、Alpl)及成骨特异性染色方面对比实验组与对照组BMSCs成骨分化能力的差异。第三步:运用real-time PCR检测实验组与对照组BMSCs中miR-150-5p的表达水平是否存在显著差异。第四步:在正常骨质老年组BMSCs中转染miR-150-5p mimic或miR-150-5p inhibitor,通过检测成骨分化基因表达水平及成骨特异性染色,验证miR-150-5p对老年人BMSCs成骨分化是否起负调控作用。第五步:运用生物信息学分析和双荧光素酶报告系统,验证miR-150-5p是否靶向结合IGF2BP1。第六步:在正常骨质老年组BMSCs分别转染miR-150-5p mimic与miR-150-5p inhibitor,检测IGF2BP1相对应的表达变化是否存在显著差异,进一步证明miR-150-5p靶向抑制IGF2BP1。第七步:运用real-time PCR检测实验组与对照组BMSCs中IGF2BP1的表达水平是否存在显著差异。第八步:在正常骨质老年组BMSCs转染IGF2BP1过表达质粒,通过检测成骨特异性染色,验证IGF2BP1对老年人BMSCs成骨分化是否起正调控作用,最终论证miR-150-5p通过靶向抑制IGF2BP1进而负调控老年人BMSCs成骨分化。结果:第一步结果:分离提取的骨质疏松老年组与正常骨质老年组两组的BMSCs均符合骨髓间充质干细胞的特性。第二步结果:骨质疏松老年组BMSCs成骨分化能力显著低于正常骨质老年组BMSCs。第三步结果:miR-150-5p在骨质疏松老年组BMSCs的表达水平显著高于正常骨质老年组BMSCs。第四步结果:miR-150-5p在老年人BMSCs成骨分化过程中起负调控作用。第五步结果:miR-150-5p靶向结合IGF2BP1的3,UTR区域。第六步结果:miR-150-5p靶向抑制IGF2BP1的表达。第七步结果:IGF2BP1在骨质疏松老年组BMSCs的表达水平显著低于正常骨质老年组BMSCs。第八步:IGF2BP1在老年人BMSCs成骨分化过程中起正调控作用,最终证明miR-150-5p通过靶向抑制IGF2BP1进而负调控老年人BMSCs成骨分化。结论:本实验前期研究通过全转录组测序与生物信息学技术分析对比骨质疏松老年组与正常骨质老年组BMSCs,筛选出具有显著性表达差异的miRNA-mRNA,即miR-150-5p—IGF2BP1信号通路。在骨质疏松老年组BMSCs中miR-150-5p表达显著增加,IGF2BP1表达显著减少。运用基因过表达及抑制表达实验,证明在老年人BMSCs成骨分化过程中miR-150-5p起抑制作用,IGF2BP1起促进作用。通过real-time PCR、双荧光素酶检测、成骨特异性染色实验,证实了miR-150-5p通过靶向抑制IGF2BP1进而调负控老年人BMSCs成骨分化,由此对寻找老年性骨质疏松的潜在治疗靶点具有重要的启示意义。
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