目的:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一大类疾病,具有较高的发病率和致死率。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)具有强大的自我更新、抗凋亡、侵袭转移能力等特异性生物学行为,因此它们被认为是促进肿瘤发生、发展的“种子”。随着肿瘤干细胞生物学行为研究的不断深入,越来越多的证据表明CSCs的生物学行为不单纯受到一个基因、一个通路的调控,而是受控于一个复杂网络调节体系。经过几十年中医药防治肿瘤的探索与实践,大量的临床研究证明了中医药在预防肿瘤复发与转移方面有明显的优势。在理论研究方面,林洪生教授基于对肿瘤发病“虚”、“毒”、“瘀”等病理因素的认识,在继承总结“扶正培本”的基础上提出了中医药防治肿瘤的“固本清源”新理论。中医药对肿瘤的治疗一方面要护机体“正气”,提高患者的防病抗病能力,纠正正气不足的病理状态来“固本”;另一方面祛除肿瘤发生,发展的致病因素,从源头上控制形成肿瘤的“邪毒”以“清源”来预防复发转移。现代医学的研究表明肿瘤干细胞是导致肿瘤发病乃至进展的最根本的“种子”,因此中医药很可能通过清除肿瘤干细胞而达到从源头上控制肿瘤的目的。而活血化瘀法是基于中医“固本清源”理论防治肿瘤的主要治法之一,因此可能通过干预肿瘤干细胞而实现防治肿瘤的作用。本研究基于中医活血化瘀法,通过探索丹参的提取物隐丹参酮对DU145前列腺癌细胞、分离及纯化的前列腺癌干细胞的干预作用,深入探讨隐丹参酮网状调控前列腺癌干细胞的作用机制,利用蛋白芯片的高通量方法揭示中药单体多靶点、复杂干预的抗肿瘤特点,丰富“固本清源”的理论内涵,从而试图应用现代医学机制研究还原中医理论,为今后进一步研究中药对肿瘤干细胞生物学行为的干预作用及其分子机制提供新的科学依据。方法:为了探索和明确丹参提取物隐丹参酮对前列腺癌干细胞的干预作用及机制,我们选择了由激素非依赖型前列腺癌细胞DU145培养纯化的前列腺癌干细胞为主要模型,研究了隐丹参酮在激素非依赖型前列腺癌中的干预作用及机制。1.DU145前列腺癌细胞系的肿瘤干细胞培养、纯化及鉴定。选择人前列腺癌DU145细胞系,应用无血清悬浮球状培养的方法获得肿瘤干细胞并进一步纯化、富集,并应用流式细胞术CD44/CD24进行肿瘤干细胞的表型鉴定,并采用异种移植实验,将DU145细胞和DU145-CSC(前列腺癌干细胞)接种到NOD/SCID小鼠双侧腋下,观察成瘤速度及成瘤率,评价前列腺癌干细胞的成瘤能力这一生物学行为。2.前列腺癌干细胞特异性生物学行为网状调控机制研究。应用蛋白芯片检测的分析方法比较DU145与DU145-CSC两种细胞的蛋白磷酸化的差异表达,对前列腺癌干细胞生物学行为的调控机制进行研究,明确肿瘤干细胞具有强大自我更新能力、抗凋亡能力等生物学行为的调控机制。3.不同中药单体对DU145前列腺癌细胞及前列腺癌干细胞的增殖干预作用。3.1基于活血解毒法筛选有效的中药单体。5种不同的中药单体:隐丹参酮、莪术醇、姜黄素、贝母素甲、藤黄酸,按浓度梯度分别处理DU145细胞,24h、48h、72h后用CCK8检测活细胞比例。3.2隐丹参酮对前列腺癌干细胞的增殖干预作用。以不同浓度的隐丹参酮处理三代以上悬浮培养获得的前列腺癌干细胞球,6h、12h、24h、48h、72h、96h用CCK8法检测活细胞比例。3.3藤黄酸对前列腺癌干细胞的增殖干预作用。以不同浓度的藤黄酸处理三代以上悬浮培养获得的前列腺癌干细胞球,6h、12h、24h、48h、72h、96h后用CCK8法检测活细胞比例。4.隐丹参酮对前列腺癌干细胞的凋亡诱导作用。以3.46μM、6.91μM、13.82μM隐丹参酮处理DU145-CSC细胞48小时后,用AV/PI将细胞染色,流式细胞仪检测凋亡细胞比例。5.隐丹参酮对前列腺癌干细胞的细胞周期的干预作用。以3.46μM、6.91μM、13.82μM隐丹参酮处理DU145-CSC细胞48小时后,用PI将细胞染色,流式细胞仪检测各周期细胞所占比例。6.隐丹参酮干预前列腺癌干细胞特异性生物学行为网状调控机制研究。应用蛋白芯片检测的分析方法比较DU145-CSC与隐丹参酮干预后CT-CSC两种细胞的蛋白磷酸化的差异表达,探索隐丹参酮干预DU145-CSC的机制。7.隐丹参酮对前列腺癌干细胞体内干预作用及机制研究。予NOD/SCID小鼠腋下接种人前列腺癌肿瘤干细胞,建立前列腺癌异种移植模型,干预组选择6.25mg/kg的隐丹参酮腹腔注射隔日一次,连续4周,每周检测小鼠瘤体体积及小鼠体重,实验结束时称取瘤重,留取瘤体组织,观察其抑瘤率,并应用Western Blot方法检测相关蛋白表达水平来探索其体内作用机制。结果:1.应用无血清悬浮培养的方法培养的干细胞微球具有前列腺癌干细胞的表面标志和较强的体内成瘤能力。1.1 DU145细胞无血清培养7天形成的干细胞微球(Tumor Spheres),传代三次以上Tumor Spheres获得相对纯化。流式细胞仪对DU145细胞及Tumor Spheres进行CD44+CD24-/low表型评价,DU145组CD44+CD24-/low表面标记检测结果为(35.45±5.05)%,而第三代 TumorSpheres 为(74.16±6.25)%(P<0.01)。1.2建立小鼠异种移植模型,比较DU145和Tumor Spheres的体内成瘤能力,Tumor Spheres成瘤时间要早于DU145细胞,且随着时间推移,增殖速度也快于DU145细胞。从成瘤率来看,2×103数量级最能体现,第30天时Tumor Spheres成瘤率为100%,而DU145细胞为20%,证实Tumor Spheres具有肿瘤干细胞特性。2.前列腺癌干细胞特异性生物学行为网状调控机制研究。应用蛋白芯片技术比较DU145与DU145-CSC两种细胞的蛋白磷酸化的差异表达,结果发现将“CSC”与“DU145”比较,在设置了cut off值:1.2(即ratio>1.2和ratio<0.833的蛋白)时,得到125个差异磷酸化蛋白,其中上调磷酸化蛋白98个,下调磷酸化蛋白27个,通过在线数据库KEGG分别映射到肿瘤相关信号通路,发现是以JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK/ERK为核心的信号通路的蛋白磷酸化表达存在差异。3.体外观察隐丹参酮、藤黄酸、贝母素甲、莪术醇、姜黄素对DU145及(或)DU145-CSC的抑制率。3.1隐丹参酮对DU145细胞增殖有明显的抑制作用,呈浓度与时间依赖性,其中48小时IC50为6.91μM,在6.25μM-50μM干预72小时后抑制作用达到最强,抑制率为95%。藤黄酸对DU145细胞增殖有明显的抑制作用,呈浓度依赖性,其中 48 小时 IC50 为 0.65μM,3.13μM-25μM 在 48h 和 72h 对 DU145 细胞的增殖抑制作用最明显,抑制率接近100%。贝母素甲和莪术醇对DU145细胞增殖没有较强的抑制作用,不同浓度在干预时间内抑制率均不大于50%。姜黄素对DU145细胞增殖有一定的抑制作用,48小时IC50为19.99μM,且随着时间的延长,对细胞增殖的抑制作用越明显。3.2隐丹参酮对DU145-CSC细胞增殖有明显的抑制作用,基本呈浓度和时间依赖性,其中48小时IC50为4.093μM,在6.25uM-25μM干预72-96h后,抑制率接近100%。藤黄酸对DU145-CSC细胞增殖有明显的抑制作用,呈浓度和时间依赖性,其中48小时IC50为0.388μM,在1.56μM-12.5μM浓度作用48小时后抑制率接近100%。与DU145细胞相比,隐丹参酮、藤黄酸对DU145-CSC有着更强的细胞增殖抑制作用。4.应用不同浓度的隐丹参酮干预DU145-CSC,观察其对细胞凋亡的影响。结果显示当3.46μM,6.91μM和13.82μM隐丹参酮干预48小时后,隐丹参酮促进DU145-CSC细胞凋亡,且呈剂量依赖性,各剂量的隐丹参酮干预后,细胞凋亡率与对照组相比有显著统计学差异(对照组早期+中晚期凋亡比例:7.27±3.34%,3.46μM组早期+中晚期凋亡比例:34.82±9.83%,6.91μM组早期+中晚期凋亡比例:42.72±11.58%,13.82μM组早期+中晚期凋亡比例:48.34±10.73%,p<0.01)。5.应用不同浓度的隐丹参酮干预DU145-CSC,观察其对细胞周期的影响。结果显示当3.46 μM,6.91μM和13.82 μ隐丹参酮干预48小时后,药物干预组分别有(66.43±0.20)%,(66.63±0.63)%和(71.95±1.64)%的细胞阻滞在 G0/G1期。而未用药物干预的对照组G0/G1期的细胞比例为(56.56±0.49)%(p<0.01)。6.隐丹参酮干预前列腺癌干细胞特异性生物学行为网状调控机制研究。应用蛋白芯片技术比较隐丹参酮干预后CSC(CT-CSC)与CSC的蛋白磷酸化的差异表达来探索隐丹参酮干预前列腺癌干细胞特异性生物学行为的调控机制,结果将“CT-CSC”与“CSC”比较,发现隐丹参酮干预后通过在线数据库KEGG分别映射到肿瘤相关信号通路,发现是以PI3K/AKT为核心的信号通路的蛋白磷酸化表达下调,具体:FAK(Phospho-Tyr861、Phospho-Tyr397)、Pyk2(Phospho-Tyr402)、Akt(Phospho-Ser473)、CREB(Phospho-Ser133)、BCL-2(Phospho-Ser70)、p70S6 Kinase(Phospho-Ser424)、14-3-3 zeta(Phospho-Ser58)等蛋白磷酸化水平下调。7.隐丹参酮对前列腺癌干细胞体内干预作用及机制研究。选择中药丹参的提取物隐丹参酮体内干预荷瘤小鼠,隐丹参酮抑瘤率为35.4%,Western Blot检测发现隐丹参酮干预组 FAK、p-FAK、PYK2、p-PYK2、p-AKT、p-CERB、p-BCL-2蛋白表达水平较对照组下降(P<0.05)。结论:1.通过表型鉴定及成瘤能力检测可以认为DU145前列腺癌细胞系能够培养分离前列腺癌干细胞(DU145-CSC),且高表达CD44+CD24-/low表型,并具有强大的自我更新能力和成瘤能力等特异性生物学行为;2.DU145-CSC 细胞中以 JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK/ERK 为核心的互有交通的网络调控体系的激活状态调控其特异性生物学行为;3.隐丹参酮可以干预DU145-CSC的生物学行为,在体外抑制DU145-CSC的增殖,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期,体内可以抑制DU145-CSC荷瘤小鼠的成瘤。4.隐丹参酮干预DU145-CSC生物学行为与其对PI3K/AKT为核心的网状体系的调控有关。