论文部分内容阅读
目的证实非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)与肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的谷氨酰胺(Gln)代谢依赖性差异,进一步探讨Gln调控Gln依赖性膀胱癌细胞的增殖和凋亡以及具体相关作用机制。方法利用Oncomine数据库检索NIMIBC与MIBC谷氨酰胺酶(GLS)的差异性表达。选取于本院行膀胱肿瘤切除术后病理结果提示移形细胞癌的临床标本,通过免疫组化技术分别检测NMIBC和MIBC临床病理标本组织中GLS的表达水平。选取膀胱癌细胞系T24、5637,利用MTT、免疫印迹、细胞凋亡等实验方法分析比较膀胱癌细胞系T24、5637的Gln依赖性差异,以及两者在Gln存在或缺乏条件下的GLS蛋白量表达、细胞增殖以及凋亡水平。针对Gln依赖性膀胱癌细胞系T24,采用细胞周期试剂盒、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、镜下观察等实验方法观察T24细胞在不同Gln浓度下细胞的生长状态以及增殖水平。通过谷氨酰胺类似物6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(Don)处理对比含谷氨酰胺(Gln+)和不含谷氨酰胺(Gln-)培养下细胞的生长状态和增殖水平。在Gln缺乏条件下,通过补充谷氨酰胺参与三羧酸(TCA)循环代谢过程中的中间产物二甲基谷氨酸(Glu)和二甲基-2-氧戊二酸(α-ΚG)以及活性氧清除剂乙酰半胱氨酸(NAC),用ATP检测试剂盒、活性氧(ROS)试剂盒、免疫荧光显微镜观察以及MTT等方法比较各组细胞的ATP、ROS含量以及增殖水平。通过流式细胞术检测Gln(+),Gln(-),Gln(-)+αKG和Gln(-)+Glu,Gln+NAC各处理组膀胱癌T24细胞的凋亡、存活状况。蛋白印迹实验用于检测不同Gln浓度条件下以及在Gln(+),Gln(-),Gln(-)+αKG和Gln(-)+Glu,Gln+NAC各不同处理组中转录因子信号转导和转录激活因子3(STAT3)以及P-STAT3蛋白和增殖相关蛋白的表达水平。结果与NMIBC相比,MIBC的GLS表达水平更高。Gln依赖程度不同的肿瘤细胞T24和5637的GLS表达水平不同。与5637相比,T24膀胱癌细胞的增殖表现出对Gln更强的依赖性。Gln的浓度越高,T24膀胱癌细胞的GLS的表达水平越高,细胞增殖越快,凋亡越少。针对Gln依赖型膀胱癌细胞T24,Gln通过提供TCA循环代谢中间产物(α-ΚG和Glu)以及作为ROS清除剂调控膀胱癌细胞系T24的增殖。与Gln(+)相比,在Gln(-)条件下,S期T24细胞的比例增加,细胞内的ATP水平降低,ROS水平增加。通过补充α-ΚG和Glu,Gln缺乏条件下细胞的ATP水平和增殖存活水平得到显著提高。此外,Gln缺乏情况下,膀胱癌细胞T24的STAT3蛋白表达水平降低,并且其STAT3表达同时受ATP和ROS含量的影响。结论与NMIBC相比,MIBC生长具有更强的Gln依赖性。Gln缺乏可能通过减少ATP产生、提高ROS含量、抑制STAT3通路等方式影响MIBC的增殖和凋亡。